小菜蛾Plutella xylostella（L.）是重要的世界性农业害虫,主要危害十字花科蔬菜。该虫世代周期短、重叠严重,基因组杂合度高,在高强度的杀虫剂选择压力下,抗药性发展迅速,防治愈发困难。自基因组破译以来,由于缺乏高效的遗传操作平台,小菜蛾的遗传研究进展缓慢。由于其灵活性与适应性,CRISPR/Cas9技术已在功能基因组学、转基因生物构建、转录调控以及基因治疗等研究领域发挥巨大作用,成为基因组编辑的主导技术。在小菜蛾中建立基于CRISPR/Cas9系统的高效遗传操作技术体系,可应用于其基因功能研究乃至种群的遗传调控。因此,结合已有的资源（基因组数据）优势,本论文基于CRISPR/Cas9技术在小菜蛾中进行了相关研究,获得以下成果:1.率先在小菜蛾中应用CRISPR/Cas9技术实现内源基因Pxabd-A的敲除。Pxabd-A在小菜蛾中存在不同的剪切体（isoform A与isoformB）,其序列仅在Ⅱ号外显子上存在五个氨基酸（DFPFP）的差异。表达谱分析表明,Pxabd-A在生长发育的各个时期均有表达,以蛹期表达量最高。通过直接注射体外转录的Cas9 mRNA和基因特异性sgRNA的方法对Pxabd-A进行编辑,可介导目标位点的插入与缺失突变,且G0代的嵌合体突变率达90%。嵌合体幼虫呈现腹节及腹足发育畸形,成虫表现为生殖器发育缺陷。该实验利用CRISPR/Cas9系统可获得生殖系基因敲除的小菜蛾,且Pxabd-A缺失的表型和基因变异均可稳定遗传至下一代,同时解析了该基因在小菜蛾腹节与生殖器发育过程中的重要作用。2.利用CRISPR/Cas9系统对小菜蛾内源基因PxAntp与PxUbx进行编辑,验证该系统在小菜蛾中进行基因编辑的普遍性。直接注射体外转录的Cas9 mRNA与sgRNA靶向基因（PxAntp与PxUbx）,可成功介导靶基因的定点编辑,呈现相应的突变表型:PxAntp突变后的幼虫,其T1、T2胸节发育异常,T2具有T1胸节的某些特征,进而影响蛹的形态和成虫翅的发育;在突变的PxUbx幼虫中,其T1-3胸节的界限被打破,皱缩或扭曲,影响成虫翅的发育。畸形个体的突变检测显示在靶点序列附近存在不同形式的插入或缺失突变。这些结果证明了 CRISPR/Cas9系统可对小菜蛾内源基因PxAntp与PxUbx进行编辑,诱导表型效应。在一定程度上,该系统可替代目前在鳞翅目中广泛应用但效率较低的RNAi策略,用于基因的功能分析。3.鉴定小菜蛾内源的U6启动子并用于小RNA的表达。本实验鉴定了 6个PxU6启动子（PxU6:1-6）,均含有Pol Ⅲ型启动子的基本特征元件:PSEA和TATA box。在小菜蛾细胞系中,不同的PxU6启动子均可驱动shRNA表达,介导EGFP的沉默。其中PxU6:3启动子驱动表达的效率最强。基于PxU6启动子的shRNA表达质粒可以用于细胞系内的shRNA的筛选及全基因组建库。4.U6:sgRNA表达质粒参与介导小菜蛾细胞（in vitro）与个体（in vivo）水平的基因定点编辑。将PxU6:3:sgRNA与Cas9表达质粒直接转染细胞,可高效介导小菜蛾细胞系中EGFP敲除。此外,PxU6:3启动子可在小菜蛾体内驱动sgRNA的表达以指导Cas9蛋白完成对Pxabd-A靶点序列的切割,介导基因突变从而诱发可稳定遗传的表型。内源性的U6启动子高效驱动sgRNA在细胞系和体内转录,可为细胞系中进行全基因组的sgRNA筛选以及转基因CRISPR/Cas9在小菜蛾中的建立奠定基础。5.tRNA-gRNA表达策略的应用及CRISPR衍生的gene drive系统的构建。利用果蝇和水稻的tRNAGly来构建PxU6:3:tRNA:sgRNA-abd-A表达质粒,注射该表达质粒至小菜蛾胚胎中,sgRNA可被转录释放并指导Cas9蛋白靶向Pxabd-A,引起靶点突变,产生的表型与注射体外转录的sgRNA所介导的一致。在小菜蛾中应用tRNA-sgRNA表达策略,可打破靶点和启动子的限制,使得CRISPR多位点编辑更为便利,并为可调控的CRISPR/Cas9系统在小菜蛾中的应用奠定基础。此外,实验通过鉴定的PxU6:3启动子驱动sgRNA靶向Px016319,尝试着在小菜蛾内构建基于CRISPR的gene drive系统,为隐性基因功能的研究及害虫遗传调控策略的建立奠定基础。综上所述,本研究初步建立了适用于小菜蛾的基因组编辑技术平台。首次利用CRISPR/Cas9系统对非模式昆虫小菜蛾的内源基因进行编辑,获得稳定突变品系;鉴定了物种特异性的内源PxU6启动子,在细胞系和小菜蛾体内驱动小RNA的表达介导基因沉默或敲除。鉴定的PxU6启动子为转基因CRISPR/Cas9以及gene drive系统在小菜蛾中的构建与应用奠定了基础,将促进小菜蛾基因功能研究及种群调控的研究。