【摘 要】
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目的 构建p62基因过表达慢病毒载体及其表达系统，并在人单核细胞白血病细胞（THP-1）中稳定表达，为在细胞水平研究p62基因的作用提供途径与方法。方法 采用聚合酶链式反应（PCR）扩增p62基因片段，将扩增产物连接至线性化pcDNA3.1-Flag-PCDH10真核表达慢病毒载体；PCR鉴定重组质粒，将构建成功的重组质粒和包装质粒共转染至人胚胎肾细胞293（HEK 293T）;用重组慢病毒感染人
【基金项目】
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国家自然科学基金（编号：82100017）； 安徽省卫生健康科研项目（编号：AHWJ2022b076）；
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目的 构建p62基因过表达慢病毒载体及其表达系统，并在人单核细胞白血病细胞（THP-1）中稳定表达，为在细胞水平研究p62基因的作用提供途径与方法。方法 采用聚合酶链式反应（PCR）扩增p62基因片段，将扩增产物连接至线性化pcDNA3.1-Flag-PCDH10真核表达慢病毒载体；PCR鉴定重组质粒，将构建成功的重组质粒和包装质粒共转染至人胚胎肾细胞293（HEK 293T）;用重组慢病毒感染人单核细胞白血病（THP-1）细胞，氨苄霉素筛选阳性细胞克隆株；Western blot和实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测高表达p62基因的THP-1细胞株（过表达组）和转染不含p62基因空质粒（对照组）的THP-1细胞株；感染肺炎克雷伯菌（Klebsiella Pneumoniae,K.p.）后，RT-qPCR检测THP-1细胞中肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-1β和趋化因子1（Cxcl1）表达水平。结果 通过PCR成功获得p62基因片段并连接到pcDNA3.1-Flag-PCDH10病毒载体上，并且PCR检测显示p62-pcDNA3.1-Flag-PCDH10重组质粒构建成功；挑选慢病毒感染THP-1细胞后抗氨苄青霉素细胞株，Western blot检测结果显示药筛存活的THP-1细胞较对照组细胞P62蛋白表达增多（P＜0.001）,且RT-qPCR检测显示p62 mRNA表达增高（P＜0.001）,说明成功构建高表达P62蛋白的THP-1细胞株；感染K.p.后，高表达P62的THP-1细胞中TNF-α、IL-1β和Cxcl1表达水平增高（P＜0.01）。结论 经三质粒包装系统可以成功构建p62-pcDNA3.1-Flag-PCDH10慢病毒载体及高表达P62蛋白THP-1细胞株，为后续p62基因的研究提供了基础。
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