【摘 要】
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谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase,GS）是合成CHO细胞生长所需要的谷氨酰胺的关键酶。为了获得能快速稳定表达外源蛋白的CHO细胞GS筛选系统，根据CRISPR/Cas9技术原理，针对GS基因设计3对sg RNA，分别将连接sg RNA的pX459质粒转染至CHO-K1细胞中以便定向敲除GS基因；经筛选后利用PCR及测序分析鉴定GS基因敲除情况；将GS基因敲除的CHO细胞株(
【机 构】
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中国检验检疫科学研究院动物检验与检疫研究所
【基金项目】
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中国检验检疫科学研究院基本科研业务费项目（2020JK020）；
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谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase,GS）是合成CHO细胞生长所需要的谷氨酰胺的关键酶。为了获得能快速稳定表达外源蛋白的CHO细胞GS筛选系统，根据CRISPR/Cas9技术原理，针对GS基因设计3对sg RNA，分别将连接sg RNA的pX459质粒转染至CHO-K1细胞中以便定向敲除GS基因；经筛选后利用PCR及测序分析鉴定GS基因敲除情况；将GS基因敲除的CHO细胞株(CHOGS-/-)分别在含有外源谷氨酰胺培养基与无谷氨酰胺培养基中进行培养，观察细胞的生长状态，绘制生长曲线，并验证该CHOGS-/-细胞株中外源基因的表达能力。结果显示，sg RNA3与sg RNA4共转染能高效双靶位敲除CHO细胞中的GS基因；生长曲线显示CHOGS-/-细胞在富含谷氨酰胺的培养基中生长速度正常或无差异，但无法在无谷氨酰胺的培养基中存活，这表明GS基因功能被破坏；外源基因表达水平及功能验证显示，敲除GS基因后不影响外源单抗在细胞中的表达。这表明，借助CRISPR/Cas9敲除系统获得了CHOGS-/-细胞，大大提高了稳定转染外源基因阳性细胞株的筛选效率，为后期利用CHO细胞大量发酵表达蛋白技术建立了坚实的分子生物学平台。
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