【摘 要】
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目的 探讨转化生长因子-β3(transforming growth factor-β3,TGF-β3)体外诱导人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,hDPSCs)成骨向分化的效果及可能机制.方法 采用免疫荧光技术观察原代hDPSCs基质细胞抗原STRO-1的免疫荧光染色情况,应用流式细胞仪检测原代hDPSCs细胞CD90、CD73、CD105表达情况,鉴别是否为hDPSCs.应用倒置显微镜观察培养第1～7天hDPSCs形态变化.原代hDPSCs传代培养至第3代对数生长期
【机 构】
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徐州市口腔医院口腔综合科,江苏徐州 221000;新疆维吾尔自治区人民医院口腔颌面外科,新疆维吾尔自治区乌鲁木齐 830001;重庆大学附属三峡医院口腔颌面外科,重庆 404000;新疆维吾尔自治区人
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目的 探讨转化生长因子-β3(transforming growth factor-β3,TGF-β3)体外诱导人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,hDPSCs)成骨向分化的效果及可能机制.方法 采用免疫荧光技术观察原代hDPSCs基质细胞抗原STRO-1的免疫荧光染色情况,应用流式细胞仪检测原代hDPSCs细胞CD90、CD73、CD105表达情况,鉴别是否为hDPSCs.应用倒置显微镜观察培养第1～7天hDPSCs形态变化.原代hDPSCs传代培养至第3代对数生长期,随机分为空白组、实验组、对照组,空白组继续在常规培养基中培养,实验组在常规培养基中加入80 μg/L TGF-β3后培养,对照组在常规培养基中加入10 mmol/L β-甘油磷酸盐、100 nmol/L地塞米松、50 mg/L抗坏血酸后培养.培养第7天,采用实时荧光定量 PCR 法检测3组细胞 TGF-β Ⅰ 型受体(TGF-β receptor type Ⅰ,TGF-βR Ⅰ)、Smad2、Smad3、Smad4 mRNA 相对表达量,采用 Western blot 法检测3组细胞骨钙素(osteocalcin,OCN)、Runx-2、TGF-βR Ⅰ、Smad2/Smad3、p-Smad2、p-Smad3、Smad4蛋白相对表达量;培养第14、21天,采用茜素红染色观察3组钙化结节情况.结果 原代hDPSCs基质细胞抗原STRO-1免疫荧光染色呈阳性,hDPSCs细胞表面CD90、CD73、CD105阳性表达率分别为93.4％、98.2％、89.1％;鉴定原代细胞为hDPSCs.第3代hDPSCs培养第1～3天,细胞多呈不规则多角形、梭形或三角形;培养第4～7天,细胞逐渐呈长条状梭形.培养第7天,实验组细胞TGF-βR Ⅰ、Smad2、Smad3、Smad4 mRNA相对表达量(1.69±0.25、1.84±0.15、1.73±0.29、1.79±0.25)均高于空白组(1.02±0.30、1.02±0.30、1.00±0.25、1.01±0.26)(P＜0.05),Smad2、Smad4 mRNA 相对表达量均高于对照组(1.41±0.11、1.33±0.12)(P＜0.05),TGF-βR Ⅰ、Smad3 mRNA相对表达量与对照组(1.50±0.12、1.43±0.24)比较差异均无统计学意义(P＞0.05);对照组细胞TGF-βR Ⅰ mRNA相对表达量高于空白组(P＜0.05),Smad2、Smad3、Smad4 mRNA相对表达量与空白组比较差异均无统计学意义(P＞0.05).实验组细胞 Runx-2、OCN、TGF-βR Ⅰ、Smad2/Smad3、p-Smad2、p-Smad3、Smad4蛋白相对表达量均高于空白组(P＜0.05),Runx-2、OCN、Smad4蛋白相对表达量均高于对照组(P＜0.05),TGF-βR Ⅰ、Smad2/Smad3、p-Smad2、p-Smad3与对照组比较差异均无统计学意义(P＞0.05);对照组细胞Runx-2、TGF-βR Ⅰ、Smad2/Smad3、p-Smad2、p-Smad3、Smad4蛋白相对表达量均高于空白组(P＜0.05),OCN蛋白相对表达量与空白组比较差异无统计学意义(P＞0.05).培养第14天,实验组、对照组出现多个大小不等的红色沉积物;培养第21天,实验组、对照组红色沉积物增多,成骨向分化程度增高,实验组矿化结节数量多于空白组、对照组.结论 TGF-β3可在体外有效促进hDPSCs的成骨向分化,其机制可能是通过提高SMAD2、SMAD4基因表达促进成骨蛋白OCN、Runx-2表达.
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