【摘 要】
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为建立基于CRISPR/Cas9技术的基因敲除细胞文库，本研究采用慢病毒转导构建稳定表达Cas9蛋白的BHK-21-Cas9单克隆细胞系。将pMD2.G、pSPAX2和lentiCas9-Blast共转染HEK-293T细胞包装慢病毒，感染BHK-21细胞后经Blasticidin S进行阳性筛选，筛选5代后通过有限稀释法培养Cas9单克隆细胞，利用Western blot检测Cas9蛋白的表达。
【基金项目】
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新疆维吾尔自治区国际合作项目（2020E01006）； 国家自然科学基金（31902271,32060042）； 新疆维吾尔自治区百名博士引进计划；
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为建立基于CRISPR/Cas9技术的基因敲除细胞文库，本研究采用慢病毒转导构建稳定表达Cas9蛋白的BHK-21-Cas9单克隆细胞系。将pMD2.G、pSPAX2和lentiCas9-Blast共转染HEK-293T细胞包装慢病毒，感染BHK-21细胞后经Blasticidin S进行阳性筛选，筛选5代后通过有限稀释法培养Cas9单克隆细胞，利用Western blot检测Cas9蛋白的表达。为获得Cas9活性强的BHK-21-Cas9单克隆细胞系，根据紧密连接蛋白（OCLN）基因序列，设计针对OCLN基因的sgRNAs,构建lentiGuide-Puro-OCLN sgRNA重组质粒，测序鉴定后将lentiGuide-Puro-OCLN sgRNA重组载体转染BHK-21-Cas9单克隆细胞系。使用嘌呤霉素进行阳性细胞筛选，经过Western blot检测OCLN蛋白的表达。Western blot检测Cas9蛋白结果显示，共获得了17株BHK-21-Cas9单克隆细胞系；测序结果显示，lentiGuide-Puro-OCLN sgRNA载体构建成功，通过Western blot鉴定，有2株Cas9编辑效果好、具有高敲除效率的BHK-21单克隆细胞系。结果表明，本研究构建了稳定表达Cas9蛋白的BHK-21-Cas9单克隆细胞系，可以用于CRISPR/Cas9敲除文库的转导，建立基因敲除细胞文库，为筛选影响病毒感染和复制的功能基因提供了科学依据。
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