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摘要：目的 在中医循证医学和转化医学理论指导下，探讨加味茵陈蒿汤对疗湿热内蕴证大鼠慢性肝损伤的治疗作用。 方法 雄性SD大鼠按体重随机分为空白组、模型组、美能片组、加味茵陈蒿汤高、中、低剂量组。除空白组外，其余各实验组大鼠复制湿热内蕴型肝损伤模型。造模48h后处死动物，采用全自动血液生化仪测定各实验组大鼠血浆ALT、AST及TB水平；Elisa法测定血浆IL-4、IL-10、IL-2、IFN-γ、TNF-a、MIP-2水平；剖取大鼠肝脏组织，石蜡包埋切片，常规HE染色，显微镜观察肝脏组织病理变化。结果 与模型组比较，加味茵陈蒿汤可显著下调大鼠血浆ALT（P <0.01）、AST（P <0.05）和TB（P <
0.01）的含量；可显著下调IL-4（P <0.05）、IL-10（P <0.05）、IL-2（P <0.05）、TNF-a（P <0.05）、MIP-2（P <0.05）含量，显著升高 IFN-γ（P <0.05）含量。可明显减轻肝细胞坏死、减少变性、减轻炎细胞浸润以及减轻肝纤维化。结论 加味茵陈蒿汤对湿热内蕴型慢性肝损伤具有显著疗效。
关键词： 加味茵陈蒿汤；慢性；肝损伤；治疗
慢性肝炎是因为肝炎病毒（湿热疫毒）侵入肝胆引起肝胆湿热，湿热郁积日久，以致肝淤血滞而出现湿热及血淤之象。如黄疸、口苦而干、胁痛、恶呕小便黄赤大便秘结舌质暗苔黄腻、脉弦滑数[1]。清利肝胆湿热的茵陈蒿汤抗肝损伤作用的研究已经得到了临床和实验研究的证实。由于慢性肝损伤中医病机的复杂性，在临床实践中单纯使用清热利湿法效果尚不能令人满意，需辨证与其他治法合用。
本实验中的加味茵陈蒿汤来自导师多年对湿热内蕴型慢性肝炎的临床治疗经验，其以茵陈蒿汤为方基，加味黄连、黄芩、黄芪及赤芍配伍。茵陈利肝清热，去湿除黄为君药；辅以栀子、黄连、黄芩清利三焦湿热；大黄通泄郁热，使湿热由粪便而下为佐药；黄芪补气升阳，固本培元，通阳利水。本方能清热利湿，使湿热从二便排出。
本研究在中医循证医学和转化医学理论指导下，以湿热内蕴型大鼠慢性肝损伤模型模拟人类湿热内蕴型慢性肝损伤发病，通过加味茵陈蒿汤对其进行治疗，旨在探究加味茵陈蒿方临床治疗湿热内蕴型慢性肝炎的药效学表征。
1 实验材料
1.1 实验动物
SD大鼠，SPF级，雄性，体重180g-220g。由成都达硕生物科技有限公司提供，动物合格证号为SCXK（川）2008-24。
1.2 受试药物
加味茵陈蒿汤，处方：茵陈30g，栀子30g，酒大黄15g，黄连15g，黄芩20g，黄芪30g，赤芍30g，药材购自成都医药大学附属医院名医堂，经成都中医药大学生药教研室鉴定为纯正药材，由成都中医药大学药学院药剂教研室制备。美能片（复方甘草酸苷），生产批号：20121014；生产厂家：日本米诺发源制药株式会社秋山片剂株式会社生产。
1.3 实验试剂
大鼠IL-4（E10J015）、IL-10（E10J112）、IL-2（E10J010） 、IFN-r （E10J0402）、TNF-α（E10J0403）、MIP-2（E10J0404）Elisa 试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所。D-氨基半乳糖胺（D-GalN）：纯度>99%，Sigma公司，生产批号1772-03-9，临用前用生理盐水配置成10%的溶液，并用1mmol/L的NaOH将PH调至7.0。
1.4 实验仪器
分立式全自动生化分析仪（BIOBASE-SAPPHIRE，山东博科生物产业有限公司）；Thermo全功能酶标仪（MK3，美国ThermoFisher仪器有限公司）；匀浆机（DY89-I，宁波新芝生物科技股份有限公司）；Image-Pro Plus图像分析系统（Media Cybernetics，美国Inc公司）；切片机电 （徕卡-2015，德国克林蓝公司）。
2 实验方法
2.1 实验分组及给药
SD大鼠，雌性，72只，按体重随机分为6组，每组12只，分别作为：①模型组：等体积无菌生理盐水；②阳性对照组（美能片组）：阳性对照组大鼠在D-GalN注射前半小时予按15.75mg/kg剂量灌胃美能片无菌生理盐水溶液；③～⑤加味茵陈蒿汤高、中、低三种剂量组：35.6 g/kg，17.8 g/kg，8.9 g/kg。另按体重随机称取12只正常大鼠作为正常组⑥：等体积无菌生理盐水。于实验第7d开始灌胃给予药物或无菌生理盐水，灌药体积为每次10ml/kg，连续灌胃7d。
2.2 湿热内蕴型慢性肝损伤模型复制方法[10]
实验第1天开始，除空白对照组外，余各组大鼠置于温度30±2℃，湿度85%±5%的造模箱内饲养15天，并同时给予高脂高糖饮食，以造成湿热内蕴证模型大鼠。实验第7天，各组除正常对照组、阳性对照组外，分别于灌胃后半小时腹腔注射D-GalN 600mg/kg以造成慢性肝损伤模型。。
3 指标检测
3.1 血浆ALT、AST及TB水平检测
造模后48h股动脉放血处死动物，收集各实验组大鼠血液，于低温离心机4℃下，4000r·min-1离心15min，采用全自动血液生化仪测定上清液ALT、AST及TB水平。
3.2 血浆IL-4、IL-10、IL-2、IFN-γ、TNF-a、MIP-2水平测定
采用免疫酶联法严格按操作流程测定各实验组大鼠血浆IL-4、IL-10、IL-2、IFN-γ、TNF-a、MIP-2水平。
3.3 肝脏组织显微镜检查
剪取病变明显的肝脏组织，用10%中性甲醛固定24h，石蜡包埋切片，常规HE染色，显微镜观察肝脏组织病理变化。 4 实验结果
4.1 对大鼠血清ALT、AST及TB水平的影响
由表1可知，与正常组比较，模型组大鼠血清ALT、AST和TB含量均有极显著升高（P <0.01）。与模型组比较，加味茵陈蒿汤高、中、低剂量组大鼠血清ALT均有极显著降低（P <0.01），AST均有显著降低（P <0.05），TB均有极显著降低（P <0.01）。
4.2 对大鼠血浆IL-4、IL-10、IL-2、IFN-γ、TNF-a、MIP-2水平的影响
由表2、表3可知，与正常组比较，模型组大鼠血清IL-4、IL-10、IL-2、IFN-γ、TNF-a以及MIP-2含量均有极显著升高（P <0.01）。与模型组比较，加味茵陈蒿汤高、中、低剂量组大鼠血浆IL-4、IL-10、IL-2、TNF-a、MIP-2含量均有显著降低（P <0.05），IFN-γ含量显著升高（P <0.05）。
4.3 肝组织病理形态检查
显微镜下，空白对照组大鼠肝细胞结构清楚，无细胞变性、坏死及炎性细胞浸润，见图1。模型组大鼠肝脏结构破坏较明显，中央静脉周围尤甚，肝细胞变性、溶解坏死、炎性细胞浸润明显，见图2。加味茵陈蒿汤高、中剂量组大鼠肝组织结构部分破坏，肝细胞变性、溶解坏死、炎性细胞润较模型组轻，高剂量组以变性为主，见图3。加味茵陈蒿汤中、低剂量组肝组织结构灶性坏死，也以中央静脉周围为甚，肝细胞变性、坏死较模型组略有减轻，分别见图4和5；美能片组大鼠肝细胞结构部分破坏，肝细胞变性、坏死较模型组略有减轻，见图6。
5 结论与讨论
中医认识到慢性肝病之所以反复发作，过程迁延难愈，与其"湿、热、毒、瘀和虚"交杂的病理特点密切相关，尤以湿热邪气为重。 因此，清热利湿法当贯穿治疗的始终，茵陈蒿汤是常用方剂之一。现代研究证实：本方具有促进胆红素代谢，解除胆汁瘀积[2～3]、抗肝损伤[4～5]、抑制肝细胞凋亡[6]、抑制星状细胞活化及胶原合成等药理作用[7～8]。同时能改善脂肪代谢[9]，广泛应用于多种肝病治疗领域。
中医临床研究发现，慢性肝病中的湿热病邪多伴有脏腑内伤的基础，故在临床治疗上要标本兼顾，在清利湿热的同时，不要忽视其与其他治法的合用。现代研究证实，慢性肝病的患者存在免疫功能的下降。如谢学军[10]检测103例慢性肝炎中医辨证为肝郁脾虚和肝胆湿热患者外周血NK细胞活性，并与30名健康人作对照，发现上述两种中医证型的患者NK活性均降低，而慢迁肝中肝胆湿热型NK活性更低，说明慢肝本虚的部分实质，强调治疗慢肝时扶正祛邪的重要性。因此，本方在茵陈蒿汤基础上加以黄芪，补气升阳，培元固本，可增强肝脏免疫功能，利于肝脏自身修复。
湿热之邪缠绵日久，湿为阴邪，其性粘腻，易遏阳气， 致气滞血淤，热为阳邪，热壅气机，阳气拂郁，气郁血瘀，实乃"湿可致瘀，热可致瘀，湿与热合，更易致瘀"[11]。病理情况下，过食膏粱厚味，"浊气"有余，化为湿热痰浊，浸淫血脉，遂成血中湿热证，故湿热内伤，日久多易深入血分。王孟英言："湿热熏蒸不已，自气入营血矣"较之气分湿热证更难治疗，表现为病情深重，湿热瘀血相互胶结，日久难愈。如华岫云在《临证指南医案》所言："郁则气滞，气滞则必化热，热郁则津液耗而不流，升降之机失度，必伤气分，久延血分，延及郁劳沉苛"。湿热之邪易于致瘀，认识这一病理特点，我们在清热利湿的茵陈蒿汤基础上加入具有活血的赤芍，阻止肝纤维化的进展，提高慢性肝病的疗效。实验表明，加味茵陈蒿汤能通过降低血浆IL-4、IL-10、IL-2、IFN-γ、TNF-a、MIP-2系列炎症因子的异常升高，减轻或消除慢性肝损伤的始动因素，是防治慢性肝损伤重要的环节，今儿减小其对肝细胞的破坏作用。在病理学改变方面，加味茵陈蒿汤既能保护肝细胞，又可以减轻肝纤维化，体现出综合治疗优势。
参 考 文 献：
[1] 张宇，谢云贵，等.当飞利肝宁胶囊治疗湿热内蕴型慢性肝炎临床研究[J].中国中西结合杂志，2009，15（12）：216-219.
[2] Nomura M. 茵陈蒿汤和熊脱氧胆酸对α-异硫氢酸萘酯引起胆汁瘀积的协同作用[M]. 国外医学中医中药分册1997， 19：40.
[3] Shoda J，Kano M，Ikegami T. Genipin enhances Mrp2（Abcc2）-mediated bile formation and organic anion transport in rat liver[J]. Hepatology 2004； 39： 167-178.
[4] 王喜军，李廷利，孙晖. 茵陈蒿汤及其血中移行成分6，7二甲氧基香豆素的肝保护作用[J]. 中国药理学通报，2004；20：239-240.
[5] Yamashiki M， Huang XX， Nobori T. Effects of the Japanese herbal medicine 'Inchinko-to' （TJ-135） onconcanavalin A-induced hepatitis in mice.[J] Clin Sci（Lond） 2009，99： 421-431.
[6] Yamamoto M，Ogawa K，Morita M，Fukuda K，Komatsu Y. The herbal medicine Inchin-ko-to inhibits liver cell apoptosis induced by transforming growth factor beta1[J]. Hepatology 2008， 23： 552-559.
[7] 陈廷玉， 卢春凤， 扈清云， 王淑香，等. 茵陈蒿汤对实验性肝纤维化大鼠肝细胞的保护作用及超微结构观察[J]. 黑龙江医药科学，2004， 27： 11-12.
[8] Inao M， Mochida S， Matsui A， Eguchi Y. Japanese herbal medicine Inchin-koto as a therapeutic drug for liver fibrosis[J]. J Hepatol， 2004， 41： 584-591.
[9] 贡瑞生，崔苏镇，潘函清，马秀璟，陈文华，张世国. 茵陈蒿汤降血脂的药理研究[J]. 中成药，2006，14：34-35.
[10] 谢学军. 慢性肝炎中医证型NK细胞活性的研究[J]. 浙江中医杂志，2005，30： 38-39.
[11] 艾军. 湿热致瘀证治浅探[J]. 新中医，2005，37：83-84.
0.01）的含量；可显著下调IL-4（P <0.05）、IL-10（P <0.05）、IL-2（P <0.05）、TNF-a（P <0.05）、MIP-2（P <0.05）含量，显著升高 IFN-γ（P <0.05）含量。可明显减轻肝细胞坏死、减少变性、减轻炎细胞浸润以及减轻肝纤维化。结论 加味茵陈蒿汤对湿热内蕴型慢性肝损伤具有显著疗效。
关键词： 加味茵陈蒿汤；慢性；肝损伤；治疗
慢性肝炎是因为肝炎病毒（湿热疫毒）侵入肝胆引起肝胆湿热，湿热郁积日久，以致肝淤血滞而出现湿热及血淤之象。如黄疸、口苦而干、胁痛、恶呕小便黄赤大便秘结舌质暗苔黄腻、脉弦滑数[1]。清利肝胆湿热的茵陈蒿汤抗肝损伤作用的研究已经得到了临床和实验研究的证实。由于慢性肝损伤中医病机的复杂性，在临床实践中单纯使用清热利湿法效果尚不能令人满意，需辨证与其他治法合用。
本实验中的加味茵陈蒿汤来自导师多年对湿热内蕴型慢性肝炎的临床治疗经验，其以茵陈蒿汤为方基，加味黄连、黄芩、黄芪及赤芍配伍。茵陈利肝清热，去湿除黄为君药；辅以栀子、黄连、黄芩清利三焦湿热；大黄通泄郁热，使湿热由粪便而下为佐药；黄芪补气升阳，固本培元，通阳利水。本方能清热利湿，使湿热从二便排出。
本研究在中医循证医学和转化医学理论指导下，以湿热内蕴型大鼠慢性肝损伤模型模拟人类湿热内蕴型慢性肝损伤发病，通过加味茵陈蒿汤对其进行治疗，旨在探究加味茵陈蒿方临床治疗湿热内蕴型慢性肝炎的药效学表征。
1 实验材料
1.1 实验动物
SD大鼠，SPF级，雄性，体重180g-220g。由成都达硕生物科技有限公司提供，动物合格证号为SCXK（川）2008-24。
1.2 受试药物
加味茵陈蒿汤，处方：茵陈30g，栀子30g，酒大黄15g，黄连15g，黄芩20g，黄芪30g，赤芍30g，药材购自成都医药大学附属医院名医堂，经成都中医药大学生药教研室鉴定为纯正药材，由成都中医药大学药学院药剂教研室制备。美能片（复方甘草酸苷），生产批号：20121014；生产厂家：日本米诺发源制药株式会社秋山片剂株式会社生产。
1.3 实验试剂
大鼠IL-4（E10J015）、IL-10（E10J112）、IL-2（E10J010） 、IFN-r （E10J0402）、TNF-α（E10J0403）、MIP-2（E10J0404）Elisa 试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所。D-氨基半乳糖胺（D-GalN）：纯度>99%，Sigma公司，生产批号1772-03-9，临用前用生理盐水配置成10%的溶液，并用1mmol/L的NaOH将PH调至7.0。
1.4 实验仪器
分立式全自动生化分析仪（BIOBASE-SAPPHIRE，山东博科生物产业有限公司）；Thermo全功能酶标仪（MK3，美国ThermoFisher仪器有限公司）；匀浆机（DY89-I，宁波新芝生物科技股份有限公司）；Image-Pro Plus图像分析系统（Media Cybernetics，美国Inc公司）；切片机电 （徕卡-2015，德国克林蓝公司）。
2 实验方法
2.1 实验分组及给药
SD大鼠，雌性，72只，按体重随机分为6组，每组12只，分别作为：①模型组：等体积无菌生理盐水；②阳性对照组（美能片组）：阳性对照组大鼠在D-GalN注射前半小时予按15.75mg/kg剂量灌胃美能片无菌生理盐水溶液；③～⑤加味茵陈蒿汤高、中、低三种剂量组：35.6 g/kg，17.8 g/kg，8.9 g/kg。另按体重随机称取12只正常大鼠作为正常组⑥：等体积无菌生理盐水。于实验第7d开始灌胃给予药物或无菌生理盐水，灌药体积为每次10ml/kg，连续灌胃7d。
2.2 湿热内蕴型慢性肝损伤模型复制方法[10]
实验第1天开始，除空白对照组外，余各组大鼠置于温度30±2℃，湿度85%±5%的造模箱内饲养15天，并同时给予高脂高糖饮食，以造成湿热内蕴证模型大鼠。实验第7天，各组除正常对照组、阳性对照组外，分别于灌胃后半小时腹腔注射D-GalN 600mg/kg以造成慢性肝损伤模型。。
3 指标检测
3.1 血浆ALT、AST及TB水平检测
造模后48h股动脉放血处死动物，收集各实验组大鼠血液，于低温离心机4℃下，4000r·min-1离心15min，采用全自动血液生化仪测定上清液ALT、AST及TB水平。
3.2 血浆IL-4、IL-10、IL-2、IFN-γ、TNF-a、MIP-2水平测定
采用免疫酶联法严格按操作流程测定各实验组大鼠血浆IL-4、IL-10、IL-2、IFN-γ、TNF-a、MIP-2水平。
3.3 肝脏组织显微镜检查
剪取病变明显的肝脏组织，用10%中性甲醛固定24h，石蜡包埋切片，常规HE染色，显微镜观察肝脏组织病理变化。 4 实验结果
4.1 对大鼠血清ALT、AST及TB水平的影响
由表1可知，与正常组比较，模型组大鼠血清ALT、AST和TB含量均有极显著升高（P <0.01）。与模型组比较，加味茵陈蒿汤高、中、低剂量组大鼠血清ALT均有极显著降低（P <0.01），AST均有显著降低（P <0.05），TB均有极显著降低（P <0.01）。
4.2 对大鼠血浆IL-4、IL-10、IL-2、IFN-γ、TNF-a、MIP-2水平的影响
由表2、表3可知，与正常组比较，模型组大鼠血清IL-4、IL-10、IL-2、IFN-γ、TNF-a以及MIP-2含量均有极显著升高（P <0.01）。与模型组比较，加味茵陈蒿汤高、中、低剂量组大鼠血浆IL-4、IL-10、IL-2、TNF-a、MIP-2含量均有显著降低（P <0.05），IFN-γ含量显著升高（P <0.05）。
4.3 肝组织病理形态检查
显微镜下，空白对照组大鼠肝细胞结构清楚，无细胞变性、坏死及炎性细胞浸润，见图1。模型组大鼠肝脏结构破坏较明显，中央静脉周围尤甚，肝细胞变性、溶解坏死、炎性细胞浸润明显，见图2。加味茵陈蒿汤高、中剂量组大鼠肝组织结构部分破坏，肝细胞变性、溶解坏死、炎性细胞润较模型组轻，高剂量组以变性为主，见图3。加味茵陈蒿汤中、低剂量组肝组织结构灶性坏死，也以中央静脉周围为甚，肝细胞变性、坏死较模型组略有减轻，分别见图4和5；美能片组大鼠肝细胞结构部分破坏，肝细胞变性、坏死较模型组略有减轻，见图6。
5 结论与讨论
中医认识到慢性肝病之所以反复发作，过程迁延难愈，与其"湿、热、毒、瘀和虚"交杂的病理特点密切相关，尤以湿热邪气为重。 因此，清热利湿法当贯穿治疗的始终，茵陈蒿汤是常用方剂之一。现代研究证实：本方具有促进胆红素代谢，解除胆汁瘀积[2～3]、抗肝损伤[4～5]、抑制肝细胞凋亡[6]、抑制星状细胞活化及胶原合成等药理作用[7～8]。同时能改善脂肪代谢[9]，广泛应用于多种肝病治疗领域。
中医临床研究发现，慢性肝病中的湿热病邪多伴有脏腑内伤的基础，故在临床治疗上要标本兼顾，在清利湿热的同时，不要忽视其与其他治法的合用。现代研究证实，慢性肝病的患者存在免疫功能的下降。如谢学军[10]检测103例慢性肝炎中医辨证为肝郁脾虚和肝胆湿热患者外周血NK细胞活性，并与30名健康人作对照，发现上述两种中医证型的患者NK活性均降低，而慢迁肝中肝胆湿热型NK活性更低，说明慢肝本虚的部分实质，强调治疗慢肝时扶正祛邪的重要性。因此，本方在茵陈蒿汤基础上加以黄芪，补气升阳，培元固本，可增强肝脏免疫功能，利于肝脏自身修复。
湿热之邪缠绵日久，湿为阴邪，其性粘腻，易遏阳气， 致气滞血淤，热为阳邪，热壅气机，阳气拂郁，气郁血瘀，实乃"湿可致瘀，热可致瘀，湿与热合，更易致瘀"[11]。病理情况下，过食膏粱厚味，"浊气"有余，化为湿热痰浊，浸淫血脉，遂成血中湿热证，故湿热内伤，日久多易深入血分。王孟英言："湿热熏蒸不已，自气入营血矣"较之气分湿热证更难治疗，表现为病情深重，湿热瘀血相互胶结，日久难愈。如华岫云在《临证指南医案》所言："郁则气滞，气滞则必化热，热郁则津液耗而不流，升降之机失度，必伤气分，久延血分，延及郁劳沉苛"。湿热之邪易于致瘀，认识这一病理特点，我们在清热利湿的茵陈蒿汤基础上加入具有活血的赤芍，阻止肝纤维化的进展，提高慢性肝病的疗效。实验表明，加味茵陈蒿汤能通过降低血浆IL-4、IL-10、IL-2、IFN-γ、TNF-a、MIP-2系列炎症因子的异常升高，减轻或消除慢性肝损伤的始动因素，是防治慢性肝损伤重要的环节，今儿减小其对肝细胞的破坏作用。在病理学改变方面，加味茵陈蒿汤既能保护肝细胞，又可以减轻肝纤维化，体现出综合治疗优势。
参 考 文 献：
[1] 张宇，谢云贵，等.当飞利肝宁胶囊治疗湿热内蕴型慢性肝炎临床研究[J].中国中西结合杂志，2009，15（12）：216-219.
[2] Nomura M. 茵陈蒿汤和熊脱氧胆酸对α-异硫氢酸萘酯引起胆汁瘀积的协同作用[M]. 国外医学中医中药分册1997， 19：40.
[3] Shoda J，Kano M，Ikegami T. Genipin enhances Mrp2（Abcc2）-mediated bile formation and organic anion transport in rat liver[J]. Hepatology 2004； 39： 167-178.
[4] 王喜军，李廷利，孙晖. 茵陈蒿汤及其血中移行成分6，7二甲氧基香豆素的肝保护作用[J]. 中国药理学通报，2004；20：239-240.
[5] Yamashiki M， Huang XX， Nobori T. Effects of the Japanese herbal medicine 'Inchinko-to' （TJ-135） onconcanavalin A-induced hepatitis in mice.[J] Clin Sci（Lond） 2009，99： 421-431.
[6] Yamamoto M，Ogawa K，Morita M，Fukuda K，Komatsu Y. The herbal medicine Inchin-ko-to inhibits liver cell apoptosis induced by transforming growth factor beta1[J]. Hepatology 2008， 23： 552-559.
[7] 陈廷玉， 卢春凤， 扈清云， 王淑香，等. 茵陈蒿汤对实验性肝纤维化大鼠肝细胞的保护作用及超微结构观察[J]. 黑龙江医药科学，2004， 27： 11-12.
[8] Inao M， Mochida S， Matsui A， Eguchi Y. Japanese herbal medicine Inchin-koto as a therapeutic drug for liver fibrosis[J]. J Hepatol， 2004， 41： 584-591.
[9] 贡瑞生，崔苏镇，潘函清，马秀璟，陈文华，张世国. 茵陈蒿汤降血脂的药理研究[J]. 中成药，2006，14：34-35.
[10] 谢学军. 慢性肝炎中医证型NK细胞活性的研究[J]. 浙江中医杂志，2005，30： 38-39.
[11] 艾军. 湿热致瘀证治浅探[J]. 新中医，2005，37：83-84.