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目的
构建AY358935基因的真核表达质粒并进行初步鉴定。
方法以逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)扩增AY358935基因的cDNA，将该片段克隆进pGEM-Teasy载体；以测序正确的pGEM-T-AY重组质粒为模板构建pcDNA3.1-AY真核表达质粒，并进行双酶切鉴定。以pcDNA3.1-AY瞬时转染M14细胞，Western印迹法和3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐[3-(4，5)- dimethylthiahiazo (-z-y1)-3, 5-di- phenytetrazoliumromide, MTT]比色法分别检测转染细胞AY358935蛋白表达水平及细胞增殖力。
结果RT-PCR扩增片段符合AY358935基因cDNA大小，与pcDNA3.1-AY克隆区酶切片段一致。对pGEM-T-AY质粒克隆区测序，结果也与AY358935基因cDNA序列相同。M14细胞分别转染AY358935基因、pcDNA3.1和脂质体48h后，AY358935基因组蛋白表达水平明显高于其余两组，且AY358935基因组细胞A值(0.74)也明显高于其余两组(0.39和0.46)，差异有统计学意义(P<0.05)。
结论AY358935基因的真核表达质粒pcDNA3.1-AY构建成功，AY358935基因可能具有促进M14细胞增殖的作用。