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摘 要：非洲猪瘟病毒（African Swine Fever Virus，ASFV）是猪的一种强毒型病原体，从2007年起在东欧流行，目前还没有有效的疫苗或治疗方法。ASF病毒是当前的流行毒株，在猪体内带毒和排毒（shedding and excretion）的动力学机理至今尚不清楚。因此，本试验希望通过将易感的家猪与经肌内注射感染ASF病毒格鲁吉亚2007/1毒株的家猪进行接触，以测定ASF病毒在猪栏内和猪栏之间由受感染猪向易感猪进行传播的动力学机理。试验采集了血液、口液、鼻液、肠液（直肠）样本，以通过病毒滴定法和实时定量PCR（qPCR）法检测ASF病毒，利用血清学试验测定ASF病毒特异性抗体。肌内注射和接触传播感染均能造成猪急性发病，不过试验表明因感染途径不同而导致猪的发病机制有所差异。接种感染猪在接种的第3天可在血液中分离到有传染性的ASF病毒，而通过直接接触和间接接触进行感染的猪分别在曝露后第10天和第13天方可从血液中分离到有传染性的ASF病毒。临近出现ASF临床症状时，ASF病毒在血液中的滴度高于在鼻液和肠液中的。口液样本中没有分离到有传染性的ASF病毒，不过ASF病毒的基因组被检测到。只有一头接种感染的猪在接种后第12天检测到ASF病毒特异性抗体。本项试验结果提供了ASF病毒格鲁吉亚2007/1毒株在家猪中带毒和排毒的定量数据，同时表明该毒株引起持续感染的能力有限。
关键词：家猪；野猪；非洲猪瘟；病毒
非洲猪瘟病毒（African Swine Fever Virus，ASFV）于2007年传播入格鲁吉亚，之后继续向东欧国家蔓延。ASF病毒属于有囊膜的DNA大病毒，是非洲猪瘟病毒属非洲猪瘟病毒科中的唯一成员，能够自然地感染家猪和野猪。非洲猪瘟（African Swine Fever，ASF）的特征性症状是受感染猪出现发热、出血和高病死率，给发病区域的养猪业带来巨大的经济损失。由于尚未建立有效的治疗措施和疫苗，所以该病只能通过采用严格的检疫限制和扑杀措施来控制。ASF病毒主要的传播方式是感染猪与易感家猪之间的直接接触和通过与受ASF病毒污染的猪肉、人群、车辆和污染物的间接接触进行传播。在东非国家，ASF病毒还可通过蜱进行传播，但蜱在该病的流行病学中所起的作用还尚未有报道。欧洲大陆将存在ASF病毒在整个大陆中发生进一步传播的风险，因此更好地了解ASF病毒在猪场中带毒和排毒（shedding and excretion）的模式是非常重要的，以便能够正确地确定疾病的传播参数，并随后将这些参数用于建立疾病传播的动力学模型。这将使人们能够评估ASF各类控制策略的潜在作用。
病毒的孵育期（从感染到出现症状之间的间隔时间）、潜伏期（从感染到出现传染性的间隔时间）、传染期（从出现传染性到死亡或机体康复之间的间隔时间）是用于阐述传染病带毒和排毒动力学的流行病学参数。强毒力的ASF病毒格鲁吉亚2007/1毒株的流行病学参数还没有通过试验进行定量。至今为止，尚无证据表明该毒株的毒力有变化和病毒的传染能继续产生急性型疾病，且尚未有家猪在感染后可康复或长期带毒的报道。孵育期、潜伏期和传染期取决于两个因素，即病毒从感染中细胞排出的数量和向体外排毒的途径；这两个因素反过来又取决于病毒的感染量和所感染的毒株。最近利用美国ASF病毒毒株进行的感染研究集中于用野猪做实验模型。野猪在攻毒后，经过3 d～4 d的孵育期开始产生临床症状，经过2 d～6 d的潜伏期病毒排出，在攻毒后（days post-inoculation）7 d～9 d （7 dpi～9 dpi）全部死亡。在从东欧ASF病毒感染区的家猪和野猪上采集的血清和器官样本中很难检测到特异性抗体，这验证了急性病例感染猪在出现可检测到的抗体之前已发病死亡的观点。其他实验性感染主要是研究家猪对在非洲流行的ASF病毒毒株的易感性：家猪在感染后，通常经过1 d～7 d的潜伏期，病毒开始排入血液。部分感染ASF病毒低毒毒株的家猪，能在感染70 d后保持持续的传染性。在此传染期中，这些感染猪通过口途径而不是鼻和直肠途径排出高水平的ASF病毒。
据我们所知，目前尚没有有关在东欧国家家猪中流行的ASF病毒毒株带毒和排毒动力学资料，因此我们在一个可控的环境中，利用ASF病毒格鲁吉亚2007/1毒株经肌内接种感染和接触感染，研究家猪的临床症状、病毒血症和病毒排毒模式，并讨论ASF检测和传播参数的重要意义。
1 材料和方法
1.1 动物和场所
本试验以40头来自英国同一家猪场的7周龄SPF大白猪（家猪）为研究对象，每头猪都进行个体鉴定，并随机分配入位于英国萨里郡的Pirbright研究所中防护等级为4级的4个独立隔离猪栏中（宽×长：385 cm～423 cm×550 cm）。试验猪每天由饲养员饲喂两次，自由饮水。我们计算可产生高传染效率（0.95）的最少配对传染/接触感染猪数，以检测试验组和对照组在病毒传播上的显著性差异（0.05）。基于此计算结果，每个试验组的传染概率P=R0/（R0 2），其中RO作为最基本的增值数（在一个易感猪群中，一头有传染性的猪在其传染期中引发新的受感染病例的平均数）。基于R0-对照组=6.9和 R0-试验组=0.5，至少需要4对有传染性的/接触的猪。计算通过R统计软件包中的“epi.studysize”方法执行。因此，猪栏A放入10头猪，猪栏B和猪栏C各饲养12头猪，在猪栏B和猪栏C中，用高80 cm的隔离物将其分隔成2个区域：一个区域饲养8头猪，另一区域饲养4头猪；通过这种方式猪栏间的传播可以进行定量分析。鉴于可用的试验猪数量有限和隔离间空间的局限，猪栏D的样本量进行了轻微的调整，因此猪栏D仅饲养6头猪。
1.2 病毒毒株
ASF病毒格鲁吉亚2007/1强毒株首次分离到是于2007年从格鲁吉亚西部伊梅列季州的一头感染猪上。该毒株与在外高加索地区和俄罗斯猪群中流行的ASF病毒毒株在遗传学上有很近的亲缘关系。试验用病毒来自受感染猪的脾脏组织，试验猪接种1 mL含量为102 HAD50的病毒液。选择102 HAD50的病毒接种量是因为此剂量早先已有研究验证其经肌内注射后可以有效地引发感染。 1.3 实验性感染和传播
试验用家猪经过5 d的适应期后通过肌内注射以上剂量的病毒进行感染。虽然肌内注射感染不能代表自然感染的方式，但却是最可靠的攻毒途径，因为可以产生较高的感染率，且能控制感染剂量和攻毒时间。接种物通过返滴定以确定感染量，表1列出了每个猪栏的肌肉接种感染和接触感染猪数，猪栏A的10头中5头进行了接种感染，猪栏B和猪栏C的12头猪中4头进行了接种感染，猪栏D的6头猪有3头进行了接种感染。未接种感染的猪如在同一猪栏中，则作为同一猪栏内的接触感染猪；如果在相邻的猪栏中，则作为猪栏与猪栏间的接触感染猪。
1.4 临床检查和尸体剖检
试验猪每天检查临床症状，为了评估疾病的严重程度，指定10个临床症状并利用临床症状评分（Clinical Score，CS）系统进行定量。动物试验在Pirbright研究所完成，直肠温度连续3 d超过40.5 ℃或者出现3个ASF临床症状的试验猪执行安乐死。每头试验猪都进行剖检并采集组织（扁桃体、脾脏、肝脏、肺脏、心脏、淋巴结）样本，依据ASF病毒感染的标准化病理学构架检测组织中的眼观病变类型。
1.5 采样步骤
在样本采集的过程中，为了避免发生污染，每头试验猪都需远离猪栏进行采样。小猪采用背部躺卧式进行保定，而大猪则采用站立式鼻套法保定。在进行连续取样时，每一次都要采集血液样本，衣物、鞋类、手套和地板都需清洗并消毒。血液和血清样本从接种感染后第3天开始到试验结束每2 d采集一次。口腔、鼻腔和直肠分泌物样本从接种感染后第2天开始每天用棉拭进行采样，采集后的棉拭浸泡在1 mL的PBS中。阴性对照样本在接种当天采集。口腔棉拭在面颊和臼齿部采集。所有的棉拭经涡旋后收集液体并保存。同时在每间猪栏中挂一根绳子，让试验猪咀嚼后再收集唾液样本。所有的样本都储存在-80 ℃下备用，之后进行病毒滴定（Virus Titration，VT）和实时定量PCR（qPCR）。
1.6 实时定量PCR（qPCR）
样本利用qPCR法检测ASF病毒基因组拷贝量，qPCR法参照 King等创立的检测方法且进行了微调。病毒DNA利用英国Qiagen公司的仿生自动机，并用Qiagen公司的核酸提取试剂盒（QIAamp? All Nucleic Acid Kit MDx Kit ）提取。DNA提取完成后，开始进行qPCR，靶基因为ASF病毒的保守序列p72基因片段。引物：5′-CTG CTC ATG GTA TCA ATC TTA TCG
A-3′和5′-GAT ACC ACA AGA TC（AG）GCC GT-3′。通过MxPro软件分析数据，qPCR程序如下：高温变性（95 ℃）、低温退火（58 ℃）和延长（72 ℃）。通过标准曲线计算ASF病毒基因组拷贝量，单位是拷贝数/mL。
1.7 病毒滴定（VT）
样本通过病毒滴定法检测传染性ASF病毒的含量，初级猪骨髓细胞接种在96孔板上，放置于5 %CO2环境下培养。3 d后，倒去培养基，加入新鲜EMEM培养基[含10 %猪血清，1︰250 HEPES和2 %抗生素溶液（青霉素、链霉素、两性霉素、卡那霉素）]。样本加入平板中，用稀释倍数为10-1～10-8的病毒溶液进行滴定，重复3次。3 d后，通过鉴定代表红细胞吸附作用（受感染细胞周围吸附着红细胞）的特征性玫瑰花环结构来测定ASF病毒的数量。ASF病毒的滴度数据用斯皮尔曼-卡勃方法计算，单位是剂量/mL（HAD50/mL）。
1.8 ASF病毒特异性抗体检测
血清样本用西班牙马德里Ingenasa公司的试剂盒（Ingezim PPA Compac kit）检测ASF病毒特异性抗体，根据说明书操作，检测针对VP72（或VP73衣壳蛋白）的抗体水平，同时计算了阴性和阳性的临界值便于结果判定。
1.9 统计分析
所有记录的临床症状和病毒模式，根据每天收集到的单头猪数据，3个试验组（接种感染猪、同栏内接触感染猪和相邻栏接触感染猪）都计算“平均值±标准差”。对于接种感染猪，我们计算了潜伏期和孵育期的平均持续时间。因为感染当天的数据不适用于接触感染猪，所以我们计算了接触感染猪从曝露到开始出现临床症状的平均持续时间。对于所有试验猪，我们计算了传染期的平均持续时间。用单因素方差法分析了试验组之间的每个不同时间段的平均持续时间，用t检验法比较了各试验组从出现临床症状到病毒排出的持续时间，用单因素方差法比较了各试验组的剖检组织病变类型。用线性混合效应模型分析了试验组之间的临床评分和带毒的数值，所有的统计分析和图表都用R统计分析软件。程序包“epi.studysize”、“lme4”、“lmerTest”、“latticeExtra”和P<0.05 用于计算统计学意义。
2 结果
2.1 孵育和传播
所有试验猪都对ASF病毒格鲁吉亚 2007/1毒株易感，因此所有的接种和接触感染猪都感染ASF病毒（表1）。除一头接种感染猪在接种后12 d进行安乐死外，其余接种感染猪都在接种后第9天实行安乐死。所有同栏内和相邻栏间的接触感染猪分别在曝露后第14和18天实行安乐死。
2.2 眼观病变
图1是3个试验组最常见的尸体剖检时观察到的眼观病变。试验组之间的眼观病变没有显著差异。观察到肿大和出血的淋巴结（下颌下、肠系膜、气管支气管、肝胃），肿大和出血的脾脏，肺脏、肾脏和肝脏上多病灶的皮层出血，以及心包腔累积的流体（心包积液）。
2.3 临床症状和孵育期
大多数猪出现发热（连续2 d以上体温超过40 ℃）、食欲减退、嗜睡和痢疾。表2列出了接种感染猪的孵育期和接触感染猪到开始出现临床症状的平均持续时间。3个试验组在到开始出现临床症状的时间上有显著的差异：接种感染猪为（4.4±1.0） dpi，同栏内的接触感染猪为（9.9±1.6） dpe（曝露后天数，days post-exposure），相邻栏的接触感染猪是（12.7±2.0） dpe。试验组之间在每天临床症状评分数值的增长上有显著差异，且往往接种感染猪的增长值分别高于同栏内和相邻栏间的接触感染猪的增长值（0.5±0.1）分/d和（0.3±0.1）分/d。 2.4 潜伏期和到出现传染性的时间
表2列出了接种感染猪潜伏期和接触感染猪到出现传染性时的平均持续时间，血液、口液、鼻液、肠液样本检测出ASF病毒基因组或传染性ASF病毒，3个试验组在血液里出现ASF病毒基因组的时间上有显著差异，但在血液中出现传染性ASF病毒的时间上没有显著差异。接种感染猪血液中分离到传染性ASF病毒的时间是（3.6±1.0） dpi，而从棉拭上分离到传染性ASF病毒的时间通常比前者的时间晚2 d。同栏内接触感染猪从血液中分离到传染性ASF病毒的时间是（10.4±1.4） dpe，但在棉拭中检测到ASF病毒基因组的时间要早几天。相邻栏接触感染猪从血液中分离到传染性ASF病毒的时间是（13.1±3.0） dpe，但在棉拭中检测到ASF病毒基因组的时间也要早几天。
根据标准差，同栏内接触感染猪到开始出现病毒血症的时间值比接种感染猪的时间值有更大的范围；同栏内接触感染猪血液中出现传染性ASF病毒的时间和临床症状没有显著差异，但接种的感染猪有显著差异。3个试验组的猪都偶尔能在鼻棉拭和直肠棉拭中分离到传染性ASF病毒，但在口腔棉拭上都未分离到。通过绳索收集到的唾液样本，经ASF病毒基因检测，猪栏A在第5天开始检测到，猪栏C在第13天开始检测到，但在这些样本中都未检测到活的传染性ASF病毒；只在一头接种感染猪中于12 dpi检测到ASF病毒特异性抗体。
2.5 ASF病毒基因组和传染性ASF病毒检测
图2列出了3个试验组在血液、口腔棉拭、鼻棉拭和直肠棉拭中检测出的ASF病毒基因组和传染性ASF病毒的平均值以及临床症状评分的平均值。血液中的ASF病毒滴度最高，从（106～108） HAD50/mL不等（图2A）。鼻棉拭和直肠棉拭偶尔能检测出到少量的ASF病毒，病毒滴度范围从（102～104） HAD50/mL不等（图2C和图2E）。3个试验组的试验猪血液中ASF病毒的每天滴度增长率有显著差异，接种感染的猪与同栏内接触感染的猪和相邻栏接触感染的猪相比，分别高出（0.5±0.1）log10 HAD50/（mL·d）和（0.3±0.1）log10 HAD50/（mL·d）。鉴于标准差，同栏内接触感染的试验组与接种感染的试验组相比，血液中的ASF病毒滴度范围更大（图2A）。鼻液和肠液样本虽能检测到高ASF病毒基因组拷贝数，但仅能偶尔分离到传染性ASF病毒（图2D和图2F）。口液样本虽能检测到ASF病毒基因组拷贝数，但未分离到传染性ASF病毒（图2H）。
2.6 传染期
表3列出了3个试验组在传染期，血液、口腔棉拭、鼻棉拭和直肠棉拭中检测出的ASF病毒基因组和传染性ASF病毒的平均持续时间。3个试验组在传染期持续时间上有显著差异。接种感染的猪血液内ASF病毒基因组和传染性ASF病毒的持续时间显著高于接触感染猪的相应值。接种感染猪的口腔棉拭、鼻棉拭和直肠棉拭中ASF病毒基因组和传染性ASF病毒的持续时间显著低于接触感染猪的相应值。
3 讨论
本项研究的目的是提供家猪感染ASF病毒格鲁吉亚2007/1毒株后机体带毒和排毒的动力学机理的定量数据。结果证实家猪对这一个在东欧国家流行的ASF病毒毒株易感，直接和间接感染都会引发急性疾病。虽然有一头接种感染猪存活了12 d，但其他接种感染的试验猪都在第9天实行了安乐死。同栏内接触感染猪和相邻栏接触感染猪分别在第14和第18天实行安乐死。试验结果表明在可控环境中，ASF病毒格鲁吉亚2007/1毒株能引起持续感染的可能性有限，家猪和野猪一样，可成为该毒株的携带者。所有试验猪都表现出温和型非特异性的临床症状。最近的文献报道了在用相似的ASF病毒毒株进行动物感染试验时以及在ASF病毒感染区域家猪暴发ASF时，家猪和野猪都能出现与本试验相似的临床症状和眼观病变。接种感染猪一般在3 dpi表现出临床症状，意味着在猪场中造成ASF病毒感染到发生疾病期间出现严重延误是有可能的。由于临床症状相似，可能会被误诊为其他出血性疾病（如猪瘟和猪皮炎与肾病综合征），这会导致疾病不能上报和ASF病毒的延迟诊断。因此当猪在猪场、市场和屠宰场的运输过程中，ASF病毒可以快速传播，但猪农往往未察觉且并不能上报疫情。
本项研究也表明了家猪通过血液接触可以传播ASF病毒，野猪亦是如此。根据血液样本的检测结果，接种感染猪、同栏内接触感染猪和相邻栏接触感染猪的潜伏期/出现传染性的平均期限分别是（3.6±1.0） d、（10.4±1.4） d和（13.1±3.0） d。相邻栏接触感染猪出现病毒血症的时间显著比同栏内接触感染猪的更迟，这说明猪场的一些基础设施，如围墙，可以延迟该疾病的传播。3个组的试验猪血液样本ASF病毒滴度范围是（106～108） HAD50/mL，比棉拭样本中的高。最近在关于动物行为学的一篇研究报道中，提到了猪平常的社群接触，如饲喂和配种，通常会引起皮肤损伤，如果有流血会出现更多的舔舐行为和咬伤情况。因此，尤其是同栏内的传播，血液更容易污染环境。血液中检测到的传染性ASF病毒含量和qPCR法检测到的ASF病毒基因组拷贝数相当，说明这个检测方法可用于该疾病控制。尽管如此，在接种感染猪的一部分血样中，病毒滴度法检测到的潜伏期比qPCR法检测到的更短，造成两者间有差异的原因还未知。用OIE的ASF病毒qPCR法检测了222份血液样本，其中仅有8份样本有误诊，说明本试验的qPCR检测方法有一致的敏感性。接触感染猪的病毒血症的起始时间和临床症状没有显著的差异，说明自然传播大多数在出现ASF症状时同步发生。这也说明基于临床症状的早期诊断并不是控制ASF病毒的有效手段，虽然其他疾病可通过此方法成功地得到根除。
此外，试验结果也表明ASF病毒可以通过口液、鼻液、直肠液传播，家猪的一些探究行为可以轻易地将病毒排到环境中，导致ASF病毒传播存在较高的可能性，尤其是相邻栏间的传播。同栏内接触感染猪和相邻栏接触感染猪在产生病毒血症前，通过鼻腔和口腔的样本检测就已经能检测到出现传染性的时间，但与血液中的传染性ASF病毒含量相比，通过这两种途径检测到的病毒含量更低，范围介于102 HAD50/mL到 104 HAD50/mL间。而且在直肠棉拭和鼻棉拭中很难分离到ASF病毒。与其他研究报道相矛盾的是，未在口腔棉拭或咀嚼过的绳索中分离到ASF病毒，虽然不能排除qPCR检测污染造成的假阳性因素，但这些现象表明可能是因为唾液中可能存在的抗体降低了ASF病毒存活率，或者是因为样本中的ASF病毒迅速失去活性，不适合通过病毒滴定法测定。接触感染猪通常在产生病毒血症之前就能在口腔和鼻腔样本中检测到ASF病毒基因组，ASF病毒在靠近最初感染部位的淋巴结中的单核细胞和巨噬细胞中开始病毒复制的这一事实也解释了这一点。因此，家猪通过接触途径感染ASF病毒时，可能在口咽区最早开始病毒复制，导致鼻腔和口腔排出传染性病毒早于病毒的全身扩散，这也预示ASF病毒可以跟典型猪瘟病毒一样，通过检测口鼻棉拭中的病毒基因组来做到早期诊断。 本项试验的多个因素阐明了因ASF病毒的感染途径不同而致ASF发病机制不同。接种感染猪最早在血液中检测到ASF病毒基因组，而接触感染猪最早在口鼻棉拭中检测到ASF病毒基因组，说明肌内接种能够更早地引起全身扩散。而且，3个试验组的试验猪血液中ASF病毒滴度的每天增长速度是显著不同的，接种感染猪的增长明显更快，表示肌内接种感染的疾病发展进程更快。虽然3个试验组的试验猪在临床症状类型上没有差异，但接种感染猪的临床症状评分值增长速度也更快。接种感染猪虽然感染的标准差更小，但根据观察到的排毒模式，表明肌内接种感染减少了自然感染的异质性。最后，虽然3个试验组所有试验猪都在自然死亡前实行了安乐死，但传染期的时间范围还存在显著差异。发病机制的不同，取决于肌内接种和自然感染途径在病毒最开始复制部位的不同，影响了带毒和排毒的动力学过程。所以，接种感染猪的数据不能代表接触感染猪ASF病毒感染的自然进程。这些实验结果表明需要未来获得更多的ASF病毒感染的数据。虽然其他感染途径没有接种感染有效，但也可以作为选择，但同时需要额外地使用再次接触感染或模式法进行传播试验。鉴于动物福利的考虑，所有试验动物在自然死亡前实行安乐死，这可能导致了观测到的传染期持续时间有偏差。尽管如此，先前已有研究，报道了相似的通常出现传染性的时间间隔，即3 d～6 d。最后，虽然先前的报道表明抗体检测对控制由ASF病毒弱毒株引发的疾病上具有重要作用，但本试验的血清学结果表明只有1头接种感染猪在12 dpi检测到ASF病毒特异性抗体。在东欧ASF病毒感染地区，目前猪发生急性型ASF，并且大多数感染猪在抗体产生之前的疾病进程早期就已死亡。所以我们的试验结果表明，只要还是针对当前流行的ASF病毒毒株，血清学检测法不是该病可靠的监控方法，除非毒株毒力发生了减弱后而出现了更长时间的感染或者持续感染。
由于许多因素，包括病毒排出、曝露时间、病毒存活、样本大小和其他实验条件会影响疾病传播研究的结果，因此试验结果应该给予认真考虑。例如，在接触感染猪中观察到的带毒或出现传染性的时间存在差异，可能是因为猪对ASF病毒易感性上存在个体差异性或者传染猪和易感猪之间接触的类型不同决定了传播的效力。尽管如此，相比于田间试验，此项试验的优势是只需要有限数量的猪，并能够进行频繁的采样和较田间试验更可控的环境。各组试验都实现了ASF病毒的传播，表明在猪场中家猪可以迅速的传播ASF。但是，田间观察表明，在ASF暴发期间，猪的死亡率也可能很低，同时尽管ASF病毒格鲁吉亚2007/1毒株有很高的毒力，在感染群体中也发现了健康猪。这也预示着因宿主特异性或者饲养方式的原因，该病可能会以不同的速度传播。总而言之，这些结果首次提供了ASF病毒传播参数的定量数据，建立了同群内ASF病毒的动态传播模式，有助于为开发和执行控制ASF传播的策略提供有效的建议。
关键词：家猪；野猪；非洲猪瘟；病毒
非洲猪瘟病毒（African Swine Fever Virus，ASFV）于2007年传播入格鲁吉亚，之后继续向东欧国家蔓延。ASF病毒属于有囊膜的DNA大病毒，是非洲猪瘟病毒属非洲猪瘟病毒科中的唯一成员，能够自然地感染家猪和野猪。非洲猪瘟（African Swine Fever，ASF）的特征性症状是受感染猪出现发热、出血和高病死率，给发病区域的养猪业带来巨大的经济损失。由于尚未建立有效的治疗措施和疫苗，所以该病只能通过采用严格的检疫限制和扑杀措施来控制。ASF病毒主要的传播方式是感染猪与易感家猪之间的直接接触和通过与受ASF病毒污染的猪肉、人群、车辆和污染物的间接接触进行传播。在东非国家，ASF病毒还可通过蜱进行传播，但蜱在该病的流行病学中所起的作用还尚未有报道。欧洲大陆将存在ASF病毒在整个大陆中发生进一步传播的风险，因此更好地了解ASF病毒在猪场中带毒和排毒（shedding and excretion）的模式是非常重要的，以便能够正确地确定疾病的传播参数，并随后将这些参数用于建立疾病传播的动力学模型。这将使人们能够评估ASF各类控制策略的潜在作用。
病毒的孵育期（从感染到出现症状之间的间隔时间）、潜伏期（从感染到出现传染性的间隔时间）、传染期（从出现传染性到死亡或机体康复之间的间隔时间）是用于阐述传染病带毒和排毒动力学的流行病学参数。强毒力的ASF病毒格鲁吉亚2007/1毒株的流行病学参数还没有通过试验进行定量。至今为止，尚无证据表明该毒株的毒力有变化和病毒的传染能继续产生急性型疾病，且尚未有家猪在感染后可康复或长期带毒的报道。孵育期、潜伏期和传染期取决于两个因素，即病毒从感染中细胞排出的数量和向体外排毒的途径；这两个因素反过来又取决于病毒的感染量和所感染的毒株。最近利用美国ASF病毒毒株进行的感染研究集中于用野猪做实验模型。野猪在攻毒后，经过3 d～4 d的孵育期开始产生临床症状，经过2 d～6 d的潜伏期病毒排出，在攻毒后（days post-inoculation）7 d～9 d （7 dpi～9 dpi）全部死亡。在从东欧ASF病毒感染区的家猪和野猪上采集的血清和器官样本中很难检测到特异性抗体，这验证了急性病例感染猪在出现可检测到的抗体之前已发病死亡的观点。其他实验性感染主要是研究家猪对在非洲流行的ASF病毒毒株的易感性：家猪在感染后，通常经过1 d～7 d的潜伏期，病毒开始排入血液。部分感染ASF病毒低毒毒株的家猪，能在感染70 d后保持持续的传染性。在此传染期中，这些感染猪通过口途径而不是鼻和直肠途径排出高水平的ASF病毒。
据我们所知，目前尚没有有关在东欧国家家猪中流行的ASF病毒毒株带毒和排毒动力学资料，因此我们在一个可控的环境中，利用ASF病毒格鲁吉亚2007/1毒株经肌内接种感染和接触感染，研究家猪的临床症状、病毒血症和病毒排毒模式，并讨论ASF检测和传播参数的重要意义。
1 材料和方法
1.1 动物和场所
本试验以40头来自英国同一家猪场的7周龄SPF大白猪（家猪）为研究对象，每头猪都进行个体鉴定，并随机分配入位于英国萨里郡的Pirbright研究所中防护等级为4级的4个独立隔离猪栏中（宽×长：385 cm～423 cm×550 cm）。试验猪每天由饲养员饲喂两次，自由饮水。我们计算可产生高传染效率（0.95）的最少配对传染/接触感染猪数，以检测试验组和对照组在病毒传播上的显著性差异（0.05）。基于此计算结果，每个试验组的传染概率P=R0/（R0 2），其中RO作为最基本的增值数（在一个易感猪群中，一头有传染性的猪在其传染期中引发新的受感染病例的平均数）。基于R0-对照组=6.9和 R0-试验组=0.5，至少需要4对有传染性的/接触的猪。计算通过R统计软件包中的“epi.studysize”方法执行。因此，猪栏A放入10头猪，猪栏B和猪栏C各饲养12头猪，在猪栏B和猪栏C中，用高80 cm的隔离物将其分隔成2个区域：一个区域饲养8头猪，另一区域饲养4头猪；通过这种方式猪栏间的传播可以进行定量分析。鉴于可用的试验猪数量有限和隔离间空间的局限，猪栏D的样本量进行了轻微的调整，因此猪栏D仅饲养6头猪。
1.2 病毒毒株
ASF病毒格鲁吉亚2007/1强毒株首次分离到是于2007年从格鲁吉亚西部伊梅列季州的一头感染猪上。该毒株与在外高加索地区和俄罗斯猪群中流行的ASF病毒毒株在遗传学上有很近的亲缘关系。试验用病毒来自受感染猪的脾脏组织，试验猪接种1 mL含量为102 HAD50的病毒液。选择102 HAD50的病毒接种量是因为此剂量早先已有研究验证其经肌内注射后可以有效地引发感染。 1.3 实验性感染和传播
试验用家猪经过5 d的适应期后通过肌内注射以上剂量的病毒进行感染。虽然肌内注射感染不能代表自然感染的方式，但却是最可靠的攻毒途径，因为可以产生较高的感染率，且能控制感染剂量和攻毒时间。接种物通过返滴定以确定感染量，表1列出了每个猪栏的肌肉接种感染和接触感染猪数，猪栏A的10头中5头进行了接种感染，猪栏B和猪栏C的12头猪中4头进行了接种感染，猪栏D的6头猪有3头进行了接种感染。未接种感染的猪如在同一猪栏中，则作为同一猪栏内的接触感染猪；如果在相邻的猪栏中，则作为猪栏与猪栏间的接触感染猪。
1.4 临床检查和尸体剖检
试验猪每天检查临床症状，为了评估疾病的严重程度，指定10个临床症状并利用临床症状评分（Clinical Score，CS）系统进行定量。动物试验在Pirbright研究所完成，直肠温度连续3 d超过40.5 ℃或者出现3个ASF临床症状的试验猪执行安乐死。每头试验猪都进行剖检并采集组织（扁桃体、脾脏、肝脏、肺脏、心脏、淋巴结）样本，依据ASF病毒感染的标准化病理学构架检测组织中的眼观病变类型。
1.5 采样步骤
在样本采集的过程中，为了避免发生污染，每头试验猪都需远离猪栏进行采样。小猪采用背部躺卧式进行保定，而大猪则采用站立式鼻套法保定。在进行连续取样时，每一次都要采集血液样本，衣物、鞋类、手套和地板都需清洗并消毒。血液和血清样本从接种感染后第3天开始到试验结束每2 d采集一次。口腔、鼻腔和直肠分泌物样本从接种感染后第2天开始每天用棉拭进行采样，采集后的棉拭浸泡在1 mL的PBS中。阴性对照样本在接种当天采集。口腔棉拭在面颊和臼齿部采集。所有的棉拭经涡旋后收集液体并保存。同时在每间猪栏中挂一根绳子，让试验猪咀嚼后再收集唾液样本。所有的样本都储存在-80 ℃下备用，之后进行病毒滴定（Virus Titration，VT）和实时定量PCR（qPCR）。
1.6 实时定量PCR（qPCR）
样本利用qPCR法检测ASF病毒基因组拷贝量，qPCR法参照 King等创立的检测方法且进行了微调。病毒DNA利用英国Qiagen公司的仿生自动机，并用Qiagen公司的核酸提取试剂盒（QIAamp? All Nucleic Acid Kit MDx Kit ）提取。DNA提取完成后，开始进行qPCR，靶基因为ASF病毒的保守序列p72基因片段。引物：5′-CTG CTC ATG GTA TCA ATC TTA TCG
A-3′和5′-GAT ACC ACA AGA TC（AG）GCC GT-3′。通过MxPro软件分析数据，qPCR程序如下：高温变性（95 ℃）、低温退火（58 ℃）和延长（72 ℃）。通过标准曲线计算ASF病毒基因组拷贝量，单位是拷贝数/mL。
1.7 病毒滴定（VT）
样本通过病毒滴定法检测传染性ASF病毒的含量，初级猪骨髓细胞接种在96孔板上，放置于5 %CO2环境下培养。3 d后，倒去培养基，加入新鲜EMEM培养基[含10 %猪血清，1︰250 HEPES和2 %抗生素溶液（青霉素、链霉素、两性霉素、卡那霉素）]。样本加入平板中，用稀释倍数为10-1～10-8的病毒溶液进行滴定，重复3次。3 d后，通过鉴定代表红细胞吸附作用（受感染细胞周围吸附着红细胞）的特征性玫瑰花环结构来测定ASF病毒的数量。ASF病毒的滴度数据用斯皮尔曼-卡勃方法计算，单位是剂量/mL（HAD50/mL）。
1.8 ASF病毒特异性抗体检测
血清样本用西班牙马德里Ingenasa公司的试剂盒（Ingezim PPA Compac kit）检测ASF病毒特异性抗体，根据说明书操作，检测针对VP72（或VP73衣壳蛋白）的抗体水平，同时计算了阴性和阳性的临界值便于结果判定。
1.9 统计分析
所有记录的临床症状和病毒模式，根据每天收集到的单头猪数据，3个试验组（接种感染猪、同栏内接触感染猪和相邻栏接触感染猪）都计算“平均值±标准差”。对于接种感染猪，我们计算了潜伏期和孵育期的平均持续时间。因为感染当天的数据不适用于接触感染猪，所以我们计算了接触感染猪从曝露到开始出现临床症状的平均持续时间。对于所有试验猪，我们计算了传染期的平均持续时间。用单因素方差法分析了试验组之间的每个不同时间段的平均持续时间，用t检验法比较了各试验组从出现临床症状到病毒排出的持续时间，用单因素方差法比较了各试验组的剖检组织病变类型。用线性混合效应模型分析了试验组之间的临床评分和带毒的数值，所有的统计分析和图表都用R统计分析软件。程序包“epi.studysize”、“lme4”、“lmerTest”、“latticeExtra”和P<0.05 用于计算统计学意义。
2 结果
2.1 孵育和传播
所有试验猪都对ASF病毒格鲁吉亚 2007/1毒株易感，因此所有的接种和接触感染猪都感染ASF病毒（表1）。除一头接种感染猪在接种后12 d进行安乐死外，其余接种感染猪都在接种后第9天实行安乐死。所有同栏内和相邻栏间的接触感染猪分别在曝露后第14和18天实行安乐死。
2.2 眼观病变
图1是3个试验组最常见的尸体剖检时观察到的眼观病变。试验组之间的眼观病变没有显著差异。观察到肿大和出血的淋巴结（下颌下、肠系膜、气管支气管、肝胃），肿大和出血的脾脏，肺脏、肾脏和肝脏上多病灶的皮层出血，以及心包腔累积的流体（心包积液）。
2.3 临床症状和孵育期
大多数猪出现发热（连续2 d以上体温超过40 ℃）、食欲减退、嗜睡和痢疾。表2列出了接种感染猪的孵育期和接触感染猪到开始出现临床症状的平均持续时间。3个试验组在到开始出现临床症状的时间上有显著的差异：接种感染猪为（4.4±1.0） dpi，同栏内的接触感染猪为（9.9±1.6） dpe（曝露后天数，days post-exposure），相邻栏的接触感染猪是（12.7±2.0） dpe。试验组之间在每天临床症状评分数值的增长上有显著差异，且往往接种感染猪的增长值分别高于同栏内和相邻栏间的接触感染猪的增长值（0.5±0.1）分/d和（0.3±0.1）分/d。 2.4 潜伏期和到出现传染性的时间
表2列出了接种感染猪潜伏期和接触感染猪到出现传染性时的平均持续时间，血液、口液、鼻液、肠液样本检测出ASF病毒基因组或传染性ASF病毒，3个试验组在血液里出现ASF病毒基因组的时间上有显著差异，但在血液中出现传染性ASF病毒的时间上没有显著差异。接种感染猪血液中分离到传染性ASF病毒的时间是（3.6±1.0） dpi，而从棉拭上分离到传染性ASF病毒的时间通常比前者的时间晚2 d。同栏内接触感染猪从血液中分离到传染性ASF病毒的时间是（10.4±1.4） dpe，但在棉拭中检测到ASF病毒基因组的时间要早几天。相邻栏接触感染猪从血液中分离到传染性ASF病毒的时间是（13.1±3.0） dpe，但在棉拭中检测到ASF病毒基因组的时间也要早几天。
根据标准差，同栏内接触感染猪到开始出现病毒血症的时间值比接种感染猪的时间值有更大的范围；同栏内接触感染猪血液中出现传染性ASF病毒的时间和临床症状没有显著差异，但接种的感染猪有显著差异。3个试验组的猪都偶尔能在鼻棉拭和直肠棉拭中分离到传染性ASF病毒，但在口腔棉拭上都未分离到。通过绳索收集到的唾液样本，经ASF病毒基因检测，猪栏A在第5天开始检测到，猪栏C在第13天开始检测到，但在这些样本中都未检测到活的传染性ASF病毒；只在一头接种感染猪中于12 dpi检测到ASF病毒特异性抗体。
2.5 ASF病毒基因组和传染性ASF病毒检测
图2列出了3个试验组在血液、口腔棉拭、鼻棉拭和直肠棉拭中检测出的ASF病毒基因组和传染性ASF病毒的平均值以及临床症状评分的平均值。血液中的ASF病毒滴度最高，从（106～108） HAD50/mL不等（图2A）。鼻棉拭和直肠棉拭偶尔能检测出到少量的ASF病毒，病毒滴度范围从（102～104） HAD50/mL不等（图2C和图2E）。3个试验组的试验猪血液中ASF病毒的每天滴度增长率有显著差异，接种感染的猪与同栏内接触感染的猪和相邻栏接触感染的猪相比，分别高出（0.5±0.1）log10 HAD50/（mL·d）和（0.3±0.1）log10 HAD50/（mL·d）。鉴于标准差，同栏内接触感染的试验组与接种感染的试验组相比，血液中的ASF病毒滴度范围更大（图2A）。鼻液和肠液样本虽能检测到高ASF病毒基因组拷贝数，但仅能偶尔分离到传染性ASF病毒（图2D和图2F）。口液样本虽能检测到ASF病毒基因组拷贝数，但未分离到传染性ASF病毒（图2H）。
2.6 传染期
表3列出了3个试验组在传染期，血液、口腔棉拭、鼻棉拭和直肠棉拭中检测出的ASF病毒基因组和传染性ASF病毒的平均持续时间。3个试验组在传染期持续时间上有显著差异。接种感染的猪血液内ASF病毒基因组和传染性ASF病毒的持续时间显著高于接触感染猪的相应值。接种感染猪的口腔棉拭、鼻棉拭和直肠棉拭中ASF病毒基因组和传染性ASF病毒的持续时间显著低于接触感染猪的相应值。
3 讨论
本项研究的目的是提供家猪感染ASF病毒格鲁吉亚2007/1毒株后机体带毒和排毒的动力学机理的定量数据。结果证实家猪对这一个在东欧国家流行的ASF病毒毒株易感，直接和间接感染都会引发急性疾病。虽然有一头接种感染猪存活了12 d，但其他接种感染的试验猪都在第9天实行了安乐死。同栏内接触感染猪和相邻栏接触感染猪分别在第14和第18天实行安乐死。试验结果表明在可控环境中，ASF病毒格鲁吉亚2007/1毒株能引起持续感染的可能性有限，家猪和野猪一样，可成为该毒株的携带者。所有试验猪都表现出温和型非特异性的临床症状。最近的文献报道了在用相似的ASF病毒毒株进行动物感染试验时以及在ASF病毒感染区域家猪暴发ASF时，家猪和野猪都能出现与本试验相似的临床症状和眼观病变。接种感染猪一般在3 dpi表现出临床症状，意味着在猪场中造成ASF病毒感染到发生疾病期间出现严重延误是有可能的。由于临床症状相似，可能会被误诊为其他出血性疾病（如猪瘟和猪皮炎与肾病综合征），这会导致疾病不能上报和ASF病毒的延迟诊断。因此当猪在猪场、市场和屠宰场的运输过程中，ASF病毒可以快速传播，但猪农往往未察觉且并不能上报疫情。
本项研究也表明了家猪通过血液接触可以传播ASF病毒，野猪亦是如此。根据血液样本的检测结果，接种感染猪、同栏内接触感染猪和相邻栏接触感染猪的潜伏期/出现传染性的平均期限分别是（3.6±1.0） d、（10.4±1.4） d和（13.1±3.0） d。相邻栏接触感染猪出现病毒血症的时间显著比同栏内接触感染猪的更迟，这说明猪场的一些基础设施，如围墙，可以延迟该疾病的传播。3个组的试验猪血液样本ASF病毒滴度范围是（106～108） HAD50/mL，比棉拭样本中的高。最近在关于动物行为学的一篇研究报道中，提到了猪平常的社群接触，如饲喂和配种，通常会引起皮肤损伤，如果有流血会出现更多的舔舐行为和咬伤情况。因此，尤其是同栏内的传播，血液更容易污染环境。血液中检测到的传染性ASF病毒含量和qPCR法检测到的ASF病毒基因组拷贝数相当，说明这个检测方法可用于该疾病控制。尽管如此，在接种感染猪的一部分血样中，病毒滴度法检测到的潜伏期比qPCR法检测到的更短，造成两者间有差异的原因还未知。用OIE的ASF病毒qPCR法检测了222份血液样本，其中仅有8份样本有误诊，说明本试验的qPCR检测方法有一致的敏感性。接触感染猪的病毒血症的起始时间和临床症状没有显著的差异，说明自然传播大多数在出现ASF症状时同步发生。这也说明基于临床症状的早期诊断并不是控制ASF病毒的有效手段，虽然其他疾病可通过此方法成功地得到根除。
此外，试验结果也表明ASF病毒可以通过口液、鼻液、直肠液传播，家猪的一些探究行为可以轻易地将病毒排到环境中，导致ASF病毒传播存在较高的可能性，尤其是相邻栏间的传播。同栏内接触感染猪和相邻栏接触感染猪在产生病毒血症前，通过鼻腔和口腔的样本检测就已经能检测到出现传染性的时间，但与血液中的传染性ASF病毒含量相比，通过这两种途径检测到的病毒含量更低，范围介于102 HAD50/mL到 104 HAD50/mL间。而且在直肠棉拭和鼻棉拭中很难分离到ASF病毒。与其他研究报道相矛盾的是，未在口腔棉拭或咀嚼过的绳索中分离到ASF病毒，虽然不能排除qPCR检测污染造成的假阳性因素，但这些现象表明可能是因为唾液中可能存在的抗体降低了ASF病毒存活率，或者是因为样本中的ASF病毒迅速失去活性，不适合通过病毒滴定法测定。接触感染猪通常在产生病毒血症之前就能在口腔和鼻腔样本中检测到ASF病毒基因组，ASF病毒在靠近最初感染部位的淋巴结中的单核细胞和巨噬细胞中开始病毒复制的这一事实也解释了这一点。因此，家猪通过接触途径感染ASF病毒时，可能在口咽区最早开始病毒复制，导致鼻腔和口腔排出传染性病毒早于病毒的全身扩散，这也预示ASF病毒可以跟典型猪瘟病毒一样，通过检测口鼻棉拭中的病毒基因组来做到早期诊断。 本项试验的多个因素阐明了因ASF病毒的感染途径不同而致ASF发病机制不同。接种感染猪最早在血液中检测到ASF病毒基因组，而接触感染猪最早在口鼻棉拭中检测到ASF病毒基因组，说明肌内接种能够更早地引起全身扩散。而且，3个试验组的试验猪血液中ASF病毒滴度的每天增长速度是显著不同的，接种感染猪的增长明显更快，表示肌内接种感染的疾病发展进程更快。虽然3个试验组的试验猪在临床症状类型上没有差异，但接种感染猪的临床症状评分值增长速度也更快。接种感染猪虽然感染的标准差更小，但根据观察到的排毒模式，表明肌内接种感染减少了自然感染的异质性。最后，虽然3个试验组所有试验猪都在自然死亡前实行了安乐死，但传染期的时间范围还存在显著差异。发病机制的不同，取决于肌内接种和自然感染途径在病毒最开始复制部位的不同，影响了带毒和排毒的动力学过程。所以，接种感染猪的数据不能代表接触感染猪ASF病毒感染的自然进程。这些实验结果表明需要未来获得更多的ASF病毒感染的数据。虽然其他感染途径没有接种感染有效，但也可以作为选择，但同时需要额外地使用再次接触感染或模式法进行传播试验。鉴于动物福利的考虑，所有试验动物在自然死亡前实行安乐死，这可能导致了观测到的传染期持续时间有偏差。尽管如此，先前已有研究，报道了相似的通常出现传染性的时间间隔，即3 d～6 d。最后，虽然先前的报道表明抗体检测对控制由ASF病毒弱毒株引发的疾病上具有重要作用，但本试验的血清学结果表明只有1头接种感染猪在12 dpi检测到ASF病毒特异性抗体。在东欧ASF病毒感染地区，目前猪发生急性型ASF，并且大多数感染猪在抗体产生之前的疾病进程早期就已死亡。所以我们的试验结果表明，只要还是针对当前流行的ASF病毒毒株，血清学检测法不是该病可靠的监控方法，除非毒株毒力发生了减弱后而出现了更长时间的感染或者持续感染。
由于许多因素，包括病毒排出、曝露时间、病毒存活、样本大小和其他实验条件会影响疾病传播研究的结果，因此试验结果应该给予认真考虑。例如，在接触感染猪中观察到的带毒或出现传染性的时间存在差异，可能是因为猪对ASF病毒易感性上存在个体差异性或者传染猪和易感猪之间接触的类型不同决定了传播的效力。尽管如此，相比于田间试验，此项试验的优势是只需要有限数量的猪，并能够进行频繁的采样和较田间试验更可控的环境。各组试验都实现了ASF病毒的传播，表明在猪场中家猪可以迅速的传播ASF。但是，田间观察表明，在ASF暴发期间，猪的死亡率也可能很低，同时尽管ASF病毒格鲁吉亚2007/1毒株有很高的毒力，在感染群体中也发现了健康猪。这也预示着因宿主特异性或者饲养方式的原因，该病可能会以不同的速度传播。总而言之，这些结果首次提供了ASF病毒传播参数的定量数据，建立了同群内ASF病毒的动态传播模式，有助于为开发和执行控制ASF传播的策略提供有效的建议。