论文部分内容阅读
【中图分类号】R78【文献标识码】A【文章编号】1550-1868（2014）10
【摘要】摘要： 目的 核干细胞因子（nucleostemin， NS）可能成为肿瘤基因治疗的潜在靶点，本文旨在构建靶向NS干扰载体pGenesil-1-NS，为后续实验奠定基礎。 方法 基于已发布的NS mRNA序列（NM_206825），选取5′-AAGCCTA GGAAAGACCCAGG-3′ （397-416）作为候选靶序列，按shRNA载体设计原则，设计合成两条互补DNA链，退火后插入载体，并以酶切和测序鉴定重组转化子。结果 经酶切及测序鉴定证实合成序列正确插入载体。结论 成功构建NS特异性干扰载体pGenesil-1-NS，可用于NS在乳腺癌中的功能研究。
【关键词】 nucleostemin 基因 pGenesil-1载体 发夹状RNA RNA干扰
核干细胞因子（ nucleostemin， NS）是2002年发现并命名的一个新蛋白，存在于多种干细胞和癌细胞的核仁中，可能是维持干细胞和癌细胞增殖所必须的蛋白质，是干细胞和肿瘤细胞通过G2 /M检验点的特异性调控因子 [1]。RNA 干扰（RNA interference， RNAi）技术可高效、特异性促使mRNA降解，从而阻断体内特定基因表达，诱使细胞出现特定基因缺失表型。在研究基因功能时，RNAi在一定程度上已逐渐代替转基因和基因敲除技术。为进一步研究NS在乳腺癌中的作用，本研究拟构建NS特异性RNAi载体，为后续实验奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料
质粒及菌株 空载体pGenesil-1（武汉晶赛公司）；大肠杆菌E.coli DH5α（本室保存）。主要试剂 T4连接酶、限制性内切酶BamHⅠ、HindⅢ、PstⅠ及SalⅠ（Takara公司）；胰蛋白胨、酵母提取物（GIBCO公司）；质粒小量提取试剂盒、凝胶回收试剂盒（OMEGA公司）；DNA Marker（DL2000、1kb ladder）（TransGene公司）；引物合成（上海英骏公司）。
1.2 方法
1.2.1真核表达载体pGenesil-1结构 该载体以U6启动子驱动表达shRNA，EGFP指示转染效率。抗Kan基因和抗neo基因分别为载体转化大肠杆菌和转染真核细胞的筛选标志。
1.2.2 NS特异性shRNA设计与合成 根据GenBank公布的人类NS mRNA （NM_206825）选取5′-AAGCCTAGGAAAGACCCAGG-3′（397-416）作为候选靶序列，按shRNA载体设计原则及载体MCS位点结构，设计的寡核苷酸结构包括：BamHⅠ+sense+loop+antisense+终止信号SalI+HindⅢ，另外一条与之互补，序列如下：NS的正义链（NSF）：5′-GATCCGCCTAGGAAAGACCCAGGAttcaagagaTCCTGGGTCTTTCCTAGGCTTTTTTGT CGACA -3′；NS的互补链（NSR）：5′-AGCTT GTCGACAAAAAAGCCTAGGAAAGACCCA
GGAtctcttgaaTCCTGGGTCTTTCCTAGGCG -3′。
1.2.3 pGenesil-1-NS的构建 两条寡核苷酸单链退火形成dsDNA，以BamHⅠ和HindⅢ双酶切质粒pGenesil-1，1%琼脂糖电泳，按凝胶回收试剂盒操作步骤回收双酶切后质粒大片段，在T4连接酶存在下，与dsDNA 16℃过夜连接，连接产物转化感受态E.coli DH5α。
1.2.4 pGenesil-1-NS的酶切及测序鉴定 在转化平板上随机挑取单克隆菌落，加入含卡那霉素 （50 mg/L） 的LB液体培养基中增菌，提取质粒，以空质粒为对照，以PstⅠ和SalⅠ酶切，1%琼脂糖凝胶电泳，鉴定重组转化子。初步鉴定为阳性的重组质粒以U6启动子通用测序引物测序鉴定，测序正确的重组质粒命名为pGenesil-1-NS。
2 结果
2.1酶切鉴定阳性转化子
重组质粒经PstⅠ和SalⅠ酶切，结果见图1。空载体可被PstⅠ酶切形成线性DNA（1泳道），经SalⅠ酶切形成约350bp的条带（2泳道）；而重组质粒因PstⅠ位点被破坏，无法切开（4泳道），经SalⅠ酶切后，出现一条约400bp的条带（5泳道），说明质粒重组成功。
2.2重组质粒测序结果
酶切初步鉴定重组成功的质粒以U6通用测序引物测序，结果见图3。插入的dsDNA（43-107 nt）序列与设计完全相同，说明载体构建成功，将其命名为pGenesil-1-NS。
3讨论
目前研究认为NS蛋白在干细胞、多种肿瘤细胞中高表达，在终末分化的细胞中不表达，可调节细胞增殖及周期进展，参与多种肿瘤的发生发展[1]。通过RNAi技术沉默NS表达，肿瘤细胞增殖率和体内成瘤能力明显降低[2]，出现肿瘤细胞分化及凋亡[3]。NS基因和蛋白的发现以及证实的其在肿瘤中的增殖作用使它可能成为肿瘤基因治疗的又一个潜在靶位。但NS在肿瘤发生、发展和转移过程中如何发挥作用尚需进一步的研究[4]。本研究成功构建了pGenesil-1-NS真核干扰载体，可为后续实验奠定基础。
基金项目吉林省卫生厅（2012Z032/2013Z054/2014Z077）；吉林市科技创新服务平台（2013625027）
参考文献
[1]Tsai R Y. McKay R D. A nucleolar mechanism controlling cell proliferation in stem cells and cancer cells[J]. Genes & Development， 2002
[2]吴鑫，胡琳，田明妹，等.核干细胞因子的最新研究进展[J].四川生理科学杂志，2013
【摘要】摘要： 目的 核干细胞因子（nucleostemin， NS）可能成为肿瘤基因治疗的潜在靶点，本文旨在构建靶向NS干扰载体pGenesil-1-NS，为后续实验奠定基礎。 方法 基于已发布的NS mRNA序列（NM_206825），选取5′-AAGCCTA GGAAAGACCCAGG-3′ （397-416）作为候选靶序列，按shRNA载体设计原则，设计合成两条互补DNA链，退火后插入载体，并以酶切和测序鉴定重组转化子。结果 经酶切及测序鉴定证实合成序列正确插入载体。结论 成功构建NS特异性干扰载体pGenesil-1-NS，可用于NS在乳腺癌中的功能研究。
【关键词】 nucleostemin 基因 pGenesil-1载体 发夹状RNA RNA干扰
核干细胞因子（ nucleostemin， NS）是2002年发现并命名的一个新蛋白，存在于多种干细胞和癌细胞的核仁中，可能是维持干细胞和癌细胞增殖所必须的蛋白质，是干细胞和肿瘤细胞通过G2 /M检验点的特异性调控因子 [1]。RNA 干扰（RNA interference， RNAi）技术可高效、特异性促使mRNA降解，从而阻断体内特定基因表达，诱使细胞出现特定基因缺失表型。在研究基因功能时，RNAi在一定程度上已逐渐代替转基因和基因敲除技术。为进一步研究NS在乳腺癌中的作用，本研究拟构建NS特异性RNAi载体，为后续实验奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料
质粒及菌株 空载体pGenesil-1（武汉晶赛公司）；大肠杆菌E.coli DH5α（本室保存）。主要试剂 T4连接酶、限制性内切酶BamHⅠ、HindⅢ、PstⅠ及SalⅠ（Takara公司）；胰蛋白胨、酵母提取物（GIBCO公司）；质粒小量提取试剂盒、凝胶回收试剂盒（OMEGA公司）；DNA Marker（DL2000、1kb ladder）（TransGene公司）；引物合成（上海英骏公司）。
1.2 方法
1.2.1真核表达载体pGenesil-1结构 该载体以U6启动子驱动表达shRNA，EGFP指示转染效率。抗Kan基因和抗neo基因分别为载体转化大肠杆菌和转染真核细胞的筛选标志。
1.2.2 NS特异性shRNA设计与合成 根据GenBank公布的人类NS mRNA （NM_206825）选取5′-AAGCCTAGGAAAGACCCAGG-3′（397-416）作为候选靶序列，按shRNA载体设计原则及载体MCS位点结构，设计的寡核苷酸结构包括：BamHⅠ+sense+loop+antisense+终止信号SalI+HindⅢ，另外一条与之互补，序列如下：NS的正义链（NSF）：5′-GATCCGCCTAGGAAAGACCCAGGAttcaagagaTCCTGGGTCTTTCCTAGGCTTTTTTGT CGACA -3′；NS的互补链（NSR）：5′-AGCTT GTCGACAAAAAAGCCTAGGAAAGACCCA
GGAtctcttgaaTCCTGGGTCTTTCCTAGGCG -3′。
1.2.3 pGenesil-1-NS的构建 两条寡核苷酸单链退火形成dsDNA，以BamHⅠ和HindⅢ双酶切质粒pGenesil-1，1%琼脂糖电泳，按凝胶回收试剂盒操作步骤回收双酶切后质粒大片段，在T4连接酶存在下，与dsDNA 16℃过夜连接，连接产物转化感受态E.coli DH5α。
1.2.4 pGenesil-1-NS的酶切及测序鉴定 在转化平板上随机挑取单克隆菌落，加入含卡那霉素 （50 mg/L） 的LB液体培养基中增菌，提取质粒，以空质粒为对照，以PstⅠ和SalⅠ酶切，1%琼脂糖凝胶电泳，鉴定重组转化子。初步鉴定为阳性的重组质粒以U6启动子通用测序引物测序鉴定，测序正确的重组质粒命名为pGenesil-1-NS。
2 结果
2.1酶切鉴定阳性转化子
重组质粒经PstⅠ和SalⅠ酶切，结果见图1。空载体可被PstⅠ酶切形成线性DNA（1泳道），经SalⅠ酶切形成约350bp的条带（2泳道）；而重组质粒因PstⅠ位点被破坏，无法切开（4泳道），经SalⅠ酶切后，出现一条约400bp的条带（5泳道），说明质粒重组成功。
2.2重组质粒测序结果
酶切初步鉴定重组成功的质粒以U6通用测序引物测序，结果见图3。插入的dsDNA（43-107 nt）序列与设计完全相同，说明载体构建成功，将其命名为pGenesil-1-NS。
3讨论
目前研究认为NS蛋白在干细胞、多种肿瘤细胞中高表达，在终末分化的细胞中不表达，可调节细胞增殖及周期进展，参与多种肿瘤的发生发展[1]。通过RNAi技术沉默NS表达，肿瘤细胞增殖率和体内成瘤能力明显降低[2]，出现肿瘤细胞分化及凋亡[3]。NS基因和蛋白的发现以及证实的其在肿瘤中的增殖作用使它可能成为肿瘤基因治疗的又一个潜在靶位。但NS在肿瘤发生、发展和转移过程中如何发挥作用尚需进一步的研究[4]。本研究成功构建了pGenesil-1-NS真核干扰载体，可为后续实验奠定基础。
基金项目吉林省卫生厅（2012Z032/2013Z054/2014Z077）；吉林市科技创新服务平台（2013625027）
参考文献
[1]Tsai R Y. McKay R D. A nucleolar mechanism controlling cell proliferation in stem cells and cancer cells[J]. Genes & Development， 2002
[2]吴鑫，胡琳，田明妹，等.核干细胞因子的最新研究进展[J].四川生理科学杂志，2013