支气管哮喘简称哮喘,是一种常见的慢性气道炎症病,在全世界影响着大约3亿患者。哮喘患者的外周血和肺组织中嗜酸性粒细胞数量明显升高,且嗜酸性粒细胞数量和哮喘病情严重程度显著相关。大量研究证明嗜酸性粒细胞胞浆内富含细胞毒性颗粒蛋白,能合成近28种细胞因子、化学因子和生长因子,还可分泌一些介导气道粘液分泌和平滑肌收缩的因子,引起气道阻塞和狭窄。嗜酸性粒细胞分泌的前炎症产物正是导致气道上皮损伤的主要因素之一。而气道上皮损伤后趋化并诱导2型辅助T淋巴细胞(Type 2 Thelper lymphocytes,Th2)启动免疫应答,释放炎症介质,引起气道反应性增高以及气道重构的发生,导致哮喘的发作。研究发现,哮喘患者体内嗜酸性粒细胞抗凋亡能力增强,这也是导致嗜酸性粒细胞在外周血和肺组织中聚积的关键因素。早期研究认为嗜酸性粒细胞存活相关因子如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)、白介素5(Interleukin,IL-5)等是哮喘中嗜酸性粒细胞气道炎症发生和维持的关键。然而新的研究发现使用GM-CSF和IL-5抗体只能部分抑制嗜酸性细胞的抗凋亡能力的增强,其他因子如IL-33、瘦素以及气道内偏酸性的pH环境等也都会影响嗜酸性粒细胞的存活,多种因素的综合作用使哮喘患者体内嗜酸性粒细胞活性的显著增强。已有研究证实抑制嗜酸性粒细胞的生成或募集可以有效缓解哮喘患者症状,因此靶向嗜酸性粒细胞的药物开发是目前哮喘治疗研究的重点所在。新版GINA指南推荐将靶向药物如Mepolizumab、Reslizumab和Benralizumab等用于重症哮喘的辅助治疗,靶向药物已逐渐进入临床。然而以单克隆抗体为主的靶向药物因其价格昂贵在很多国家中的使用受到了一定的限制,因此开发价格低廉疗效显著的哮喘治疗药物迫在眉睫。青蒿琥酯(Artesunate,ART)是一种国内自主产权的半合成青蒿素类衍生物,其钠盐具有良好的水溶性,是临床一线抗疟疾治疗药物。2015年10月,中国药理学家屠呦呦正因发现了青蒿素荣获诺贝尔生理学或医学奖。现有研究发现青蒿琥酯在治疗疟疾之外还抗肿瘤及抗炎等多种作用,其能够通过p53、Bcl-2家族诱导线粒体功能丧失,诱导肿瘤细胞程序性死亡,具有治疗乳腺癌、结直肠癌和肝细胞肝癌的作用,而相关的临床研究也已进入Ⅱ期试验阶段。此外,青蒿琥酯可以通过k基因结合核转录因子(Nuclear factor-k-gene bindingk,NF-κB)信号通路及相关分子实现抗炎症的作用,在自身免疫性疾病和变态反应性疾病中均有较好的效果,青蒿琥酯在系统性红斑狼疮中的治疗研究目前已进入Ⅳ期临床试验阶段。考虑到在哮喘发病过程中伴随着嗜酸性粒细胞抗凋亡能力的增强,同时哮喘也是一种慢性气道炎症,且综合目前研究进展青蒿琥酯在促进肿瘤细胞凋亡的同时还有良好的抗炎症作用,青蒿琥酯是否能够通过促进嗜酸性粒细胞凋亡达到缓解哮喘患者的嗜酸性粒细胞气道炎症值得我们进一步研究。此外,计算机辅助技术为预测青蒿琥酯在哮喘中的作用提供了非常多的便利。全基因组关联分析研究(Genome Wide Association Study,GWAS)的兴起为了解哮喘的发病机制和靶向药物的开发提供了新思路。GEO(Gene Expression Omnibus)数据库是 NCBI(National Center for Biotechnology Information)下一个收录 了多物种多疾病多样本全基因组表达信息的在线公共数据库。GEO数据库收录了各亚型哮喘患者标本的测序结果,并提供数据的下载和在线分析服务。研究者可以通过GEO数据库提供的在线分析工具GE02R对已均一化的测序数据进行差异性表达分析,得到差异性表达基因,再对得到的差异性表达基因进行功能富集分类、蛋白质相互作用等分析,对了解重症哮喘的发病机制明确发病过程具有一定的辅助作用。而分子对接(Docking)则是计算化学的一种手段,是用软件将配体小分子和受体大分子的活性位点充分接近,依据两者的几何性质、能量关系和所处的化学环境评估两者相互作用的强弱、评价小分子配体药效的好坏的一种方法。以分子对接为代表的计算模拟方法的开发极大地提高了新药物的设计研发效率,也为我们预测青蒿琥酯在哮喘中的作用提供了新的思路。综合现有研究情况,本文主要研究了青蒿琥酯在气道局部用药的情况下对哮喘模型小鼠的作用及相关机制,探索了青蒿琥酯对嗜酸性粒细胞的作用。最后,本研究还借助生物信息学的方法分析了 GEO数据库中的数据,预测了青蒿琥酯作为哮喘靶向治疗药物的可能性。目的研究青蒿琥酯在哮喘嗜酸性粒细胞气道炎症模型中的作用,探讨其对嗜酸性粒细胞的具体作用机制。利用生物信息学的方法分析预测青蒿琥酯作为哮喘靶向治疗药物的可能性。方法第一部分对野生型小鼠气道滴注屋尘螨抗原(House dust mite antigen,HDM)构建HDM哮喘模型。对模型小鼠气道滴注不同浓度青蒿琥酯,检测各组小鼠气道嗜酸性粒细胞炎症情况。探索青蒿琥酯最佳作用剂量。第二部分构建HDM哮喘模型小鼠,气道滴注青蒿琥酯,观察青蒿琥酯对小鼠体内嗜酸性粒细胞的作用和机制。提取HDM模型小鼠的肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid,BALF)·和IL-5转基因小鼠NJ.1638的外周血嗜酸性粒细胞,体外用青蒿琥酯干预,研究青蒿琥酯在体外对嗜酸性粒细胞的作用和机制。对野生型小鼠气道滴注细菌脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)构建小鼠中性粒细胞气道炎症模型。对LPS模型小鼠气道滴注青蒿琥酯,检测小鼠气道炎症情况。提取LPS模型小鼠肺泡灌洗液细胞体外培养并干预青蒿琥酯,研究青蒿琥酯对嗜酸粒细胞作用是否具有特异性。第三部分富集人外周血嗜酸性粒细胞,体外用青蒿琥酯干预后研究其对人嗜酸性粒细胞的作用。从GEO数据库下载哮喘患者肺泡灌洗液测序数据集GSE74986,用生物信息学工具进行分析,得到重症哮喘发病相关的重要基因和蛋白,并研究预测青蒿琥酯和这些蛋白相互作用的情况。根据青蒿琥酯的化学结构分析其可能作用的靶蛋白和治疗的疾病,探索青蒿琥酯成为哮喘治疗药物的可能性。结果第一部分1.HDM模型小鼠BALF嗜酸性粒细胞比例明显升高至61.2±3.9%,用50μg/50μl NS青蒿琥酯气道滴注后比例下降为3.9±3.4%(P<0.05)。嗜酸性粒细胞总数从(32.0±10.3)x104/ml 下降至(0.4±0.3)x104/ml(P<0.05)。2.当青蒿琥酯剂量大于10μg青蒿琥酯(Artesunate,ART)/50μl生理盐水(Normal saline,NS)时,HDM模型小鼠BALF嗜酸比例下降幅度变化不大。青蒿琥酯最佳作用剂量为50μg ART/50μl NS。3.经50μg ART/50μl NS青蒿琥酯气道用药治疗后的模型小鼠小气道周围炎症细胞浸润情况及气道黏液分泌情况均明显好转,炎症评分从3.7±0.5降至0.3±0.5,黏液评分从3.2±0.8降至0.3±0.6(P<0.05)。小鼠肺组织Th2型炎症因子IL-4、IL-13、IL-17、IL-25、IL-33和黏液分泌相关因子Muc5ac的表达均有不同程度的下降(P<0.05)。第二部分1.经50μg ART/50μl NS青蒿琥酯治疗后的HDM模型小鼠BALF中炎症细胞均有不同程度的空泡变性,细胞Bcl-2的表达量下降而Cleaved Caspase-9的表达量升高。治疗后模型小鼠肺组织Bcl-2的表达量也下降。2.提取HDM模型小鼠BALF中细胞进行体外培养,用10μM青蒿琥酯干预12小时后白细胞存活率下降,嗜酸性粒细胞数目从(20.5±2.4)x103/ml下降至(9.8±1.5)x103/ml(P<0.05),增加青蒿琥酯浓度至50μM和100μM,白细胞存活率和存活嗜酸性粒细胞数目进一步下降(P<0.05)。光学显微镜下可见处理后的细胞形态结构发生变化。免疫荧光结果显示干预后BALF细胞Cleaved Caspase-9表达升高。3.提取小鼠外周血嗜酸性粒细胞体外培养24小时,对照组嗜酸性粒细胞存活数目为(57.7±1.8)x104/ml,10μM、50μM、100μM青蒿琥酯干预组,嗜酸性粒细胞存活数目明显下降至(31.9± 1.7)x104/ml、(24.8±1.0)x104/ml 和(21.3±2.4)x104/ml(P<0.05)。光学显微镜下可见青蒿琥酯干预后嗜酸性粒细胞形态被破坏。免疫荧光结果显示经青蒿琥酯干预后嗜酸性粒细胞Cleaved Caspase-9表达量上升,蛋白印迹法结果提示活化的Cleaved Caspase-9表达量升高。4.对LPS模型小鼠气道滴注浓度为750μg ART/50μl NS青蒿琥酯,小鼠BALF中性粒细胞比例和数目并无显著改变。提取LPS模型小鼠BALF进行体外培养并用青蒿琥酯干预12小时后,中性粒细胞存活情况无显著性差别。第三部分1.富集人外周血嗜酸性粒细胞体外培养24小时,用10μM、50μM、100μM青蒿琥酯干预后,对照组存活嗜酸性粒细胞百分比为60.9±2.8%,干预组嗜酸性粒细胞百分比显著下降至 38.8±8.1%、29.7±7.7%和 27.3±1.8%(P<0.05)。2.对GEO数据库中数据集GSE74986进行对比分析,得到重症哮喘相关的差异性表达基因1121个,其中508个表达上调的基因,613个表达下调的基因。3.富集分析结果示上调基因主要和淋巴细胞活化、凋亡信号通路、细胞因子生成、体液免疫、系统性红斑狼疮等过程和信号通路相关。下调基因主要和细胞核内部分、液泡形成、免疫调节、吞噬信号通路等过程和信号通路相关。4.蛋白质相互作用分析结果示上调蛋白中关键的蛋白有TCF7、LEF和SMC1A等,而下调蛋白中关键的蛋白为UBC、DHX9和POLR2B等。5.根据蛋白质数据库(Protein data bank,PDB)筛选蛋白互作分析结果,得到化学结构明确且活性位点已知的关键蛋白7种:CDC16、DHX9、FCH02、FUS、SISH1、SYNJ1和UBA3。用青蒿琥酯及蛋白天然配体和蛋白分别进行分子对接结果示青蒿琥酯与关键蛋白相互作用强。6.根据青蒿琥酯化学结构与活性基团预测其靶蛋白有CAT、VEGFA、NFE2L2、TLR4、MMP、GSTM2、CASP3、GCLM、NACA、RPL41,靶蛋白和疾病关系预测结果示青蒿琥酯可能具有靶向治疗哮喘作用。结论气道滴注青蒿琥酯可以缓解哮喘模型小鼠气道嗜酸性粒细胞炎症。这一作用主要通过Bcl-2、Caspase-9分子介导的嗜酸性粒细胞凋亡实现。青蒿琥酯能够诱导人外周血嗜酸性粒细胞凋亡,利用生物信息学方法进行预测分析,结果提示青蒿琥酯可能可能具有靶向治疗哮喘的作用。