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摘 要 目的 研究植物生长调节剂对G-2产鬼臼毒素的影响。方法 采用HPLC法检测。结果 实验表明6-苄氨基嘌呤（6-BA）浓度为4 mg/L、萘乙酸（NAA）浓度为4 mg/L、6-BA和NAA浓度比为3：5时该菌产鬼臼毒素的量分别为： 455.72 €%eg/L、450.48 €%eg/L、932.39 €%eg/L，且6-BA和NAA对菌丝体的生长均有促进作用。
关键词 植物生长调节剂 内生真菌 生物合成 鬼臼毒素
药用植物桃儿七是我国一级保护植物为小檗科鬼臼属植物桃儿七的根及根状茎，是我国特有种，主要分布于陕西、甘肃、青海、四川、云南、西藏等地，人工栽培尚未规模化，药材主要来源于野生，多年生草本植物，属于“太白七药”之一，具有良好的抗癌作用。其主要药用成分是以鬼臼毒素为代表的木脂素类化合物，具有显著的抗肿瘤活性以及治疗尖锐湿疣和抑菌等作用。
目前用微生物发酵的方法生产鬼臼毒素，是解决药源问题的有效途径。提高内生菌产鬼臼毒素的产量是人们关注的热点。有人发现将植物生长调节剂加入细胞培养物中可显著提高细胞中鬼臼毒素的产量，但这些研究主要集中在细胞培养方面，将植物生长调节剂加入内生真菌细胞发酵液中研究其对鬼臼毒素含量变化的影响国内尚未见报道。本研究在内生真菌发酵指数期加入植物生长调节剂，研究其对鬼臼毒素含量变化的影响，为提高鬼臼毒素的产量提供一种新的方法。
一、材料与方法
（一）材料
菌种 桃儿七内生真菌G-2，由陕西国际商贸学院微生物实验室提供。
培养基 斜面培养基：马铃薯200.0 g，葡萄糖20.0g， MgSO4 ·7H2O 3.0 g，KH2 PO4 5 .0g，VB 1 10.0mg，琼脂粉12g，pH自然。
发酵培养基：马铃薯200.0g，葡萄糖40.0g，蛋白胨5.0g，酵母膏0.8g，（NH4） 2SO4 3.0g，KH2PO4 2.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，VB1 10.0mg，水1000.0mL，pH自然。
设备 高效液相色谱仪；紫外检测器；旋转蒸发仪。
（二）方法
液体发酵 挑取0.5 cm2活化菌种接到液体培养基中，28℃ 静置培养24 h，转入28 ℃，160 r/min振荡培养，待菌丝体生长至指数期时向发酵液中加入不同浓度的植物生长调节剂进行培养。
分离提取 用布什漏斗抽滤过滤发酵液，菌丝球冻融（-20℃），菌液称量体积。取菌液于45℃旋转蒸发至1/10体积后，加入等体积的氯仿进行萃取，收集氯仿相；菌丝体烘干，放入研钵研磨至菌丝体完全破碎，然后加入一定量的氯仿超声波提取3次，每次30min，收集氯仿相。合并氯仿相，并于60℃旋转蒸发至干，用无水乙醇溶解后定容至10ml，置4℃冰箱保存，备用。
分析检测 标品用甲醇定容，配置成0.01-0.08 mg/mL的梯度，绘制标准曲线。色谱条件：色谱柱采用C18（4.6mm€？50mm，5€%em），紫外检测波长290nm，流动相为：乙腈：水=45：55，设置流速为1ml/min。精密称取鬼臼毒素标准品约2 mg，甲醇定容至10 mL，得母液浓度为0.2 mg/mL，将母液依次稀释成浓度梯度为0.08 mg/mL、0.04 mg/mL、0.02 mg/mL、0.01 mg/mL，取20 €%eL进样（N=4），得回归方程为 y=6.0453+3726.3824x，r=0.9994建立标准曲线，采用外标法测定发酵产物抽提物中鬼臼毒素产量。
二、结果与分析
6-BA对G-2生物合成鬼臼毒素的影响
内生真菌G-2液体发酵至7d时，加入不同浓度的6-BA，研究其对生物合成鬼臼毒素的影响。结果见图1所示。
图1表明，在使用6-BA诱导G-2生物合成鬼臼毒素时，鬼臼毒素的产量随6-BA浓度的增大而增加。当6-BA的浓度达到4.0 mg/L时，鬼臼毒素产量达到峰值，即455.72 €%eg/L。相比本底水平鬼臼毒素的产量增加不明显。当6-BA浓度继续增大，鬼臼毒素的产量随之减小。结果表明，发酵液中6-BA浓度0～5.0 mg/L浓度范围内，6-BA对鬼臼毒素的生物合成有促进作用，但影响不明显，但6-BA的加入对菌丝体生长有促进作用。
NAA对G-2生物合成鬼臼毒素的影响
内生真菌G-2液体发酵至7d时，加入不同浓度的NAA，添加范围是0～5 mg/L，研究其对生物合成鬼臼毒素的影响。结果见图2所示。
图2表明，在使用NAA诱导G-2生物合成鬼臼毒素时，发酵液中鬼臼毒素的产量随NAA浓度的增大而增加，当NAA的浓度达到4.0 mg/L时，鬼臼毒素的产量达到峰值，即450.48 €%eg/L。相比本底水平，鬼臼毒素的产量增加不明显。当NAA浓度继续增大，发酵液中鬼臼毒素的产量随之减小。结果表明，在NAA浓度0～5.0 mg/L范围内，NAA对鬼臼毒素的生物合成有促进作用，但影响不明显，但NAA的加入对菌丝体生长有促进作用。
不同混合浓度6-BA 和NAA对G-2生物合成鬼臼毒素的影响
内生真菌G-2液体发酵至7d时，加入不同混合浓度的6-BA 和NAA，研究其对生物合成鬼臼毒素的影响。结果见图3所示。
图3表明，在使用不同混合浓度的6-BA和NAA诱导G-2生物合成鬼臼毒素时，发酵液中鬼臼毒素的产量随不同混合浓度比例发生变化，当6-BA和NAA的浓度比例为3：5时，鬼臼毒素的产量达到峰值，即932.39 €%eg/L。相比本底水平，鬼臼毒素的产量增加明显。
三、讨论
植物内生真菌是一类应用前景广阔的资源微生物，用微生物发酵方法生产鬼臼毒素，是解决药源问题的有效途径，且提高内生真菌产鬼臼毒素的量是目前研究的热点。
本研究通过在桃儿七内生真菌液体发酵过程中添加植物生长调节剂，研究对G-2生物合成的鬼臼毒素影响。表明6-BA和NAA，6-BA和NAA不同混合浓度对G-2生物合成鬼臼毒素也有一定的促进作用，并且6-BA和NAA都可以促进G-2菌丝体的生长。
参考文献：
[1]傅志军，张萍.太白山国家保护植物优先保护顺序的定量分析[J].山地学报，2001， 19（2）：161-164.
[2]马绍宾；胡志浩.桃儿七分布格局与生态适应的初步研究[J].武汉植物学研究，1996 （01）： 135-137.
[3]何建清；陈芝兰.桃儿七的经济价值及栽培技术[J].中国野生植物资源. 2003 （03）： 189-193.
[4]刘芸，殷红，彭辉，等.植物内生真菌潜在的天然药物新来源[J].中华现代中西医杂志，2005，3（5）：404-405.
关键词 植物生长调节剂 内生真菌 生物合成 鬼臼毒素
药用植物桃儿七是我国一级保护植物为小檗科鬼臼属植物桃儿七的根及根状茎，是我国特有种，主要分布于陕西、甘肃、青海、四川、云南、西藏等地，人工栽培尚未规模化，药材主要来源于野生，多年生草本植物，属于“太白七药”之一，具有良好的抗癌作用。其主要药用成分是以鬼臼毒素为代表的木脂素类化合物，具有显著的抗肿瘤活性以及治疗尖锐湿疣和抑菌等作用。
目前用微生物发酵的方法生产鬼臼毒素，是解决药源问题的有效途径。提高内生菌产鬼臼毒素的产量是人们关注的热点。有人发现将植物生长调节剂加入细胞培养物中可显著提高细胞中鬼臼毒素的产量，但这些研究主要集中在细胞培养方面，将植物生长调节剂加入内生真菌细胞发酵液中研究其对鬼臼毒素含量变化的影响国内尚未见报道。本研究在内生真菌发酵指数期加入植物生长调节剂，研究其对鬼臼毒素含量变化的影响，为提高鬼臼毒素的产量提供一种新的方法。
一、材料与方法
（一）材料
菌种 桃儿七内生真菌G-2，由陕西国际商贸学院微生物实验室提供。
培养基 斜面培养基：马铃薯200.0 g，葡萄糖20.0g， MgSO4 ·7H2O 3.0 g，KH2 PO4 5 .0g，VB 1 10.0mg，琼脂粉12g，pH自然。
发酵培养基：马铃薯200.0g，葡萄糖40.0g，蛋白胨5.0g，酵母膏0.8g，（NH4） 2SO4 3.0g，KH2PO4 2.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，VB1 10.0mg，水1000.0mL，pH自然。
设备 高效液相色谱仪；紫外检测器；旋转蒸发仪。
（二）方法
液体发酵 挑取0.5 cm2活化菌种接到液体培养基中，28℃ 静置培养24 h，转入28 ℃，160 r/min振荡培养，待菌丝体生长至指数期时向发酵液中加入不同浓度的植物生长调节剂进行培养。
分离提取 用布什漏斗抽滤过滤发酵液，菌丝球冻融（-20℃），菌液称量体积。取菌液于45℃旋转蒸发至1/10体积后，加入等体积的氯仿进行萃取，收集氯仿相；菌丝体烘干，放入研钵研磨至菌丝体完全破碎，然后加入一定量的氯仿超声波提取3次，每次30min，收集氯仿相。合并氯仿相，并于60℃旋转蒸发至干，用无水乙醇溶解后定容至10ml，置4℃冰箱保存，备用。
分析检测 标品用甲醇定容，配置成0.01-0.08 mg/mL的梯度，绘制标准曲线。色谱条件：色谱柱采用C18（4.6mm€？50mm，5€%em），紫外检测波长290nm，流动相为：乙腈：水=45：55，设置流速为1ml/min。精密称取鬼臼毒素标准品约2 mg，甲醇定容至10 mL，得母液浓度为0.2 mg/mL，将母液依次稀释成浓度梯度为0.08 mg/mL、0.04 mg/mL、0.02 mg/mL、0.01 mg/mL，取20 €%eL进样（N=4），得回归方程为 y=6.0453+3726.3824x，r=0.9994建立标准曲线，采用外标法测定发酵产物抽提物中鬼臼毒素产量。
二、结果与分析
6-BA对G-2生物合成鬼臼毒素的影响
内生真菌G-2液体发酵至7d时，加入不同浓度的6-BA，研究其对生物合成鬼臼毒素的影响。结果见图1所示。
图1表明，在使用6-BA诱导G-2生物合成鬼臼毒素时，鬼臼毒素的产量随6-BA浓度的增大而增加。当6-BA的浓度达到4.0 mg/L时，鬼臼毒素产量达到峰值，即455.72 €%eg/L。相比本底水平鬼臼毒素的产量增加不明显。当6-BA浓度继续增大，鬼臼毒素的产量随之减小。结果表明，发酵液中6-BA浓度0～5.0 mg/L浓度范围内，6-BA对鬼臼毒素的生物合成有促进作用，但影响不明显，但6-BA的加入对菌丝体生长有促进作用。
NAA对G-2生物合成鬼臼毒素的影响
内生真菌G-2液体发酵至7d时，加入不同浓度的NAA，添加范围是0～5 mg/L，研究其对生物合成鬼臼毒素的影响。结果见图2所示。
图2表明，在使用NAA诱导G-2生物合成鬼臼毒素时，发酵液中鬼臼毒素的产量随NAA浓度的增大而增加，当NAA的浓度达到4.0 mg/L时，鬼臼毒素的产量达到峰值，即450.48 €%eg/L。相比本底水平，鬼臼毒素的产量增加不明显。当NAA浓度继续增大，发酵液中鬼臼毒素的产量随之减小。结果表明，在NAA浓度0～5.0 mg/L范围内，NAA对鬼臼毒素的生物合成有促进作用，但影响不明显，但NAA的加入对菌丝体生长有促进作用。
不同混合浓度6-BA 和NAA对G-2生物合成鬼臼毒素的影响
内生真菌G-2液体发酵至7d时，加入不同混合浓度的6-BA 和NAA，研究其对生物合成鬼臼毒素的影响。结果见图3所示。
图3表明，在使用不同混合浓度的6-BA和NAA诱导G-2生物合成鬼臼毒素时，发酵液中鬼臼毒素的产量随不同混合浓度比例发生变化，当6-BA和NAA的浓度比例为3：5时，鬼臼毒素的产量达到峰值，即932.39 €%eg/L。相比本底水平，鬼臼毒素的产量增加明显。
三、讨论
植物内生真菌是一类应用前景广阔的资源微生物，用微生物发酵方法生产鬼臼毒素，是解决药源问题的有效途径，且提高内生真菌产鬼臼毒素的量是目前研究的热点。
本研究通过在桃儿七内生真菌液体发酵过程中添加植物生长调节剂，研究对G-2生物合成的鬼臼毒素影响。表明6-BA和NAA，6-BA和NAA不同混合浓度对G-2生物合成鬼臼毒素也有一定的促进作用，并且6-BA和NAA都可以促进G-2菌丝体的生长。
参考文献：
[1]傅志军，张萍.太白山国家保护植物优先保护顺序的定量分析[J].山地学报，2001， 19（2）：161-164.
[2]马绍宾；胡志浩.桃儿七分布格局与生态适应的初步研究[J].武汉植物学研究，1996 （01）： 135-137.
[3]何建清；陈芝兰.桃儿七的经济价值及栽培技术[J].中国野生植物资源. 2003 （03）： 189-193.
[4]刘芸，殷红，彭辉，等.植物内生真菌潜在的天然药物新来源[J].中华现代中西医杂志，2005，3（5）：404-405.