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【摘要】建立气相色谱法分析雷替曲塞中有机溶剂残留。雷替曲塞中有机溶剂主要有甲醇、乙醚、石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿和二甲基甲酰胺等有机溶剂残留。方法采用B-1石英毛细管柱，采用程序升温，气化室：200℃，检测器：250℃，恒温载气N2。七种有机溶剂的线性关系良好，相关系数r>0.999。七种溶剂残留的加样回收RS分别为94.25%，98.81%，110.24%，105.34%，101.57%，92.57%和94.55%。本方法简单、准确、灵敏度高、重现性好。
【关键词】气相色谱法；有机溶剂残留；雷替曲塞；抗肿瘤药
雷替曲塞是一种新一代水溶性胸腺合成酶抑制剂，属于一种喹唑啉叶酸盐类似物。该药通过细胞膜外还原型叶酸盐载体系统将本品主动摄入细胞内，而后迅速代谢为多谷氨酸类化合物抑制胸苷酸合酶的活性，从而抑制细胞NA的合成，并能在细胞内潴留，长时间发挥作用。它对结肠直肠癌细胞系的抑制作用强于5-氟尿嘧啶，且雷替曲塞（图1的副反应发生率低，方法简便，患者易于接受。雷替曲塞特点：①作用机制独特：本品特异性亦自胸腺嘧啶核苷的合成，而对RNA不起作用，避免了因对RNA有影响而产生的副作用。②耐受性好，副作用少：出现白细胞减少、黏膜炎、溃疡等副作用的比例减小，大大提高了完成全部治疗的病人比例。③给药方式简便、节约总体费用：本品的给药方式为每三周一次，每次约15分钟静脉输注；而以5-氟尿嘧啶为主的联合化疗需每4周给药一次，每次连续5天给药。因此本品从整体上大大减少住户李、支持治疗等多方面的费用。④疗效确切：对于进展性结肠癌，本品的反应率为14-26%，本品的合成工艺分为3部分，第1部分为噻吩-2-甲酸中羧基的酰氯化、N-酰化、硝基还原、N-甲基化，得到中间体Ⅰ；第2部分为5-甲基-2-氨基-苯甲酸与硫代乙酰胺的环合、芳环侧链的卤代反应，得到中间体Ⅱ；第3部分Ⅰ+Ⅱ的N-烷基化反应及酯的水解反应，得到终产物。在该药的制备过程中，使用了甲醇、乙醚、石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿和二甲基甲酰胺等有机溶剂，本文建立了气相色谱法测定其溶剂残留，方法简单、准确、灵敏度高、重现性好。
1仪器与试剂
仪器：ShimadzuGC-14B，FI检测器，N-2000色谱工作站（浙江大学信息工程研究所。
试剂：甲醇（色谱纯，美国Fisher Scientific公司；乙醚（分析纯，济南元通化工有限公司；石油醚（60-90℃，分析纯，济南元通化工有限公司；乙酸乙酯（分析纯，上海试剂-厂；氯仿（分析纯，上海试剂-厂；二甲基甲酰胺（分析纯，江苏汉邦科技有限公司；二甲亚砜（分析纯，上海久意化学试剂有限公司；水为双重蒸馏水。
样品：雷替曲塞对照品（河南天方药业股份有限公司药物研究所，批号为120752，含量100.0%和注射用雷替曲塞（江苏正大天晴药业股份有限公司，批号为130319。
2方法与结果
2.1色谱条件色谱柱：B-1石英毛细管柱（30m×0.53mmI..×1.0m；柱温：起始30℃，3min，再以20℃min-1升至80℃，随后以30℃min-1降至20℃，最后以50℃min-1升至200℃并停留4min；气化室：200℃；检测器：250℃；恒温载气N2；进样量：2l（不分流进样。其理论塔板数不得低于4000，分离度应大于1.0。
2.2标准储备液制备分别精密称取甲醇0.1491g、乙醚0.1503g、石油醚0.1519g、乙酸乙酯0.1488g、二氯甲烷0.1528g、氯仿0.1533g和二甲基甲酰胺0.1478g、置同一25ml量瓶中，加二甲亚砜溶解定容至刻度，摇匀，精密吸取此溶液5.0ml置50ml量瓶中，加二甲亚砜稀释至刻度，摇匀，即得。
2.3线性范围精密量取标准储备液0.3、0.6、1.0、2.5、4.0ml，分别置10ml量瓶中，用二甲亚砜稀释，充分摇匀，分别吸取上述标准溶液2.0l进样，记录色谱图，得到各待结果表明，在所测定的浓度范围内，待测溶剂的浓度和峰面积比值间有良好的线性关系（相关系数>0.999。
2.4最低检测限试验取标准曲线项下1号溶液，用二甲亚砜稀释1000倍，当信噪比SN=3时，得到本法对各待测溶剂的最低检测限：甲醇9.35ng、乙醚10.12ng、石油醚9.57ng、乙酸乙酯9.29ng、二氯甲烷10.28ng、氯仿10.86ng和二甲基甲酰胺10.17ng。
2.5精密度试验取标准曲线项下的第3号溶液，精密吸取2l，进样6次，计算得甲醇、乙醚、石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿和二甲基甲酰胺峰面积的RS%值分别为：，2.38，2.26，7.69，6.94，5.88，6.27，5.46。
2.6加样回收率试验精密测定雷替曲塞样品约30mg，精密加入标准储备液1.0ml，混匀，进样2l，计算得甲醇、乙醚、石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿和二甲基甲酰胺的平均回收率（n=3分别为：94.25%，98.81%，110.24%，105.34%，101.57%，92.57%和94.55%。
2.7样品测定精密称取雷替曲塞对照品及样品各约30mg，置10ml量瓶中加二甲亚砜溶解，精密吸取2l进样，记录峰面积，结果表明样品中有极少量残留，均在标准曲线最低点以下，说明样品符合要求。
3讨论
人用药品注册技术规范国际协调（ICH在关于有机溶剂残留量的指导原则中将二氯甲烷列为第二类必須控制的毒性试剂，将乙醚列为第三类低毒性的溶剂[1]。甲醇、乙醚、石油醚、氯仿易对黏膜产生刺激，使鼻黏膜出血，喉头发炎，嗅觉丧失，或因皮肤敏感产生红肿、发痒、红斑、坏疽病等。本品合成所用的七种有机溶剂在测定时，由于柱长有限，互相之间易产生干扰，因而需考虑结合极性与沸点的差异将其分离。根据《化学药物残留溶剂研究的技术指导原则》[2]本品及残留的有机溶剂能在二甲亚砜中溶解，并且溶解性好、沸点高、出峰晚的二甲亚砜为溶剂。考虑到乙酸乙酯与甲醇机型相似，故测定样品时采用降温（30℃min-1降至20℃改善其分离[3]，以保证分离度大于1。有机溶剂基本上按照极性的顺序出峰，测定时色谱体系采用程序升温的方法，加快出峰和改善峰形。测定的结果表明样品中乙酸乙酯和二甲基甲酰胺有少量残留（远低于限量。故该法用于有机溶剂的含量测定准确，可信。
参考文献
[1]周海均.药品注册的国际技术要求质量部分.北京：人民卫生出版社，2000：79.
[2]国家药品审评中心.化学药物残留溶剂研究的技术指导原则[Z].2005.
[3]沙云菲，蔡磊，黄滔敏，段更利.雷替曲塞中有机溶剂残留量的毛细管气相色谱法测定[J].中国新药与临床杂志，2004，23（10：674-676.
【关键词】气相色谱法；有机溶剂残留；雷替曲塞；抗肿瘤药
雷替曲塞是一种新一代水溶性胸腺合成酶抑制剂，属于一种喹唑啉叶酸盐类似物。该药通过细胞膜外还原型叶酸盐载体系统将本品主动摄入细胞内，而后迅速代谢为多谷氨酸类化合物抑制胸苷酸合酶的活性，从而抑制细胞NA的合成，并能在细胞内潴留，长时间发挥作用。它对结肠直肠癌细胞系的抑制作用强于5-氟尿嘧啶，且雷替曲塞（图1的副反应发生率低，方法简便，患者易于接受。雷替曲塞特点：①作用机制独特：本品特异性亦自胸腺嘧啶核苷的合成，而对RNA不起作用，避免了因对RNA有影响而产生的副作用。②耐受性好，副作用少：出现白细胞减少、黏膜炎、溃疡等副作用的比例减小，大大提高了完成全部治疗的病人比例。③给药方式简便、节约总体费用：本品的给药方式为每三周一次，每次约15分钟静脉输注；而以5-氟尿嘧啶为主的联合化疗需每4周给药一次，每次连续5天给药。因此本品从整体上大大减少住户李、支持治疗等多方面的费用。④疗效确切：对于进展性结肠癌，本品的反应率为14-26%，本品的合成工艺分为3部分，第1部分为噻吩-2-甲酸中羧基的酰氯化、N-酰化、硝基还原、N-甲基化，得到中间体Ⅰ；第2部分为5-甲基-2-氨基-苯甲酸与硫代乙酰胺的环合、芳环侧链的卤代反应，得到中间体Ⅱ；第3部分Ⅰ+Ⅱ的N-烷基化反应及酯的水解反应，得到终产物。在该药的制备过程中，使用了甲醇、乙醚、石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿和二甲基甲酰胺等有机溶剂，本文建立了气相色谱法测定其溶剂残留，方法简单、准确、灵敏度高、重现性好。
1仪器与试剂
仪器：ShimadzuGC-14B，FI检测器，N-2000色谱工作站（浙江大学信息工程研究所。
试剂：甲醇（色谱纯，美国Fisher Scientific公司；乙醚（分析纯，济南元通化工有限公司；石油醚（60-90℃，分析纯，济南元通化工有限公司；乙酸乙酯（分析纯，上海试剂-厂；氯仿（分析纯，上海试剂-厂；二甲基甲酰胺（分析纯，江苏汉邦科技有限公司；二甲亚砜（分析纯，上海久意化学试剂有限公司；水为双重蒸馏水。
样品：雷替曲塞对照品（河南天方药业股份有限公司药物研究所，批号为120752，含量100.0%和注射用雷替曲塞（江苏正大天晴药业股份有限公司，批号为130319。
2方法与结果
2.1色谱条件色谱柱：B-1石英毛细管柱（30m×0.53mmI..×1.0m；柱温：起始30℃，3min，再以20℃min-1升至80℃，随后以30℃min-1降至20℃，最后以50℃min-1升至200℃并停留4min；气化室：200℃；检测器：250℃；恒温载气N2；进样量：2l（不分流进样。其理论塔板数不得低于4000，分离度应大于1.0。
2.2标准储备液制备分别精密称取甲醇0.1491g、乙醚0.1503g、石油醚0.1519g、乙酸乙酯0.1488g、二氯甲烷0.1528g、氯仿0.1533g和二甲基甲酰胺0.1478g、置同一25ml量瓶中，加二甲亚砜溶解定容至刻度，摇匀，精密吸取此溶液5.0ml置50ml量瓶中，加二甲亚砜稀释至刻度，摇匀，即得。
2.3线性范围精密量取标准储备液0.3、0.6、1.0、2.5、4.0ml，分别置10ml量瓶中，用二甲亚砜稀释，充分摇匀，分别吸取上述标准溶液2.0l进样，记录色谱图，得到各待结果表明，在所测定的浓度范围内，待测溶剂的浓度和峰面积比值间有良好的线性关系（相关系数>0.999。
2.4最低检测限试验取标准曲线项下1号溶液，用二甲亚砜稀释1000倍，当信噪比SN=3时，得到本法对各待测溶剂的最低检测限：甲醇9.35ng、乙醚10.12ng、石油醚9.57ng、乙酸乙酯9.29ng、二氯甲烷10.28ng、氯仿10.86ng和二甲基甲酰胺10.17ng。
2.5精密度试验取标准曲线项下的第3号溶液，精密吸取2l，进样6次，计算得甲醇、乙醚、石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿和二甲基甲酰胺峰面积的RS%值分别为：，2.38，2.26，7.69，6.94，5.88，6.27，5.46。
2.6加样回收率试验精密测定雷替曲塞样品约30mg，精密加入标准储备液1.0ml，混匀，进样2l，计算得甲醇、乙醚、石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿和二甲基甲酰胺的平均回收率（n=3分别为：94.25%，98.81%，110.24%，105.34%，101.57%，92.57%和94.55%。
2.7样品测定精密称取雷替曲塞对照品及样品各约30mg，置10ml量瓶中加二甲亚砜溶解，精密吸取2l进样，记录峰面积，结果表明样品中有极少量残留，均在标准曲线最低点以下，说明样品符合要求。
3讨论
人用药品注册技术规范国际协调（ICH在关于有机溶剂残留量的指导原则中将二氯甲烷列为第二类必須控制的毒性试剂，将乙醚列为第三类低毒性的溶剂[1]。甲醇、乙醚、石油醚、氯仿易对黏膜产生刺激，使鼻黏膜出血，喉头发炎，嗅觉丧失，或因皮肤敏感产生红肿、发痒、红斑、坏疽病等。本品合成所用的七种有机溶剂在测定时，由于柱长有限，互相之间易产生干扰，因而需考虑结合极性与沸点的差异将其分离。根据《化学药物残留溶剂研究的技术指导原则》[2]本品及残留的有机溶剂能在二甲亚砜中溶解，并且溶解性好、沸点高、出峰晚的二甲亚砜为溶剂。考虑到乙酸乙酯与甲醇机型相似，故测定样品时采用降温（30℃min-1降至20℃改善其分离[3]，以保证分离度大于1。有机溶剂基本上按照极性的顺序出峰，测定时色谱体系采用程序升温的方法，加快出峰和改善峰形。测定的结果表明样品中乙酸乙酯和二甲基甲酰胺有少量残留（远低于限量。故该法用于有机溶剂的含量测定准确，可信。
参考文献
[1]周海均.药品注册的国际技术要求质量部分.北京：人民卫生出版社，2000：79.
[2]国家药品审评中心.化学药物残留溶剂研究的技术指导原则[Z].2005.
[3]沙云菲，蔡磊，黄滔敏，段更利.雷替曲塞中有机溶剂残留量的毛细管气相色谱法测定[J].中国新药与临床杂志，2004，23（10：674-676.