【摘 要】
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为探究伴侣蛋白Hfq与GcvB及其靶基因oppA可能存在的关键作用位点,本研究通过λ-Red同源重组技术构建Hfq远端面和近端面核心氨基酸的突变菌株及Hfq C-端截短菌株,在此基础上构建相应的Hfq-His6标签蛋白标签融合菌株.运用P22噬菌体转导技术构建相应的GcvB基因缺失菌株以及oppA::lacZ基因融合菌株.通过Western blotting试验检测Hfq蛋白水平,实时荧光定量PCR检测GcvB和oppA基因转录水平,β-半乳糖苷酶试验检测oppA蛋白水平.Western blotting
【机 构】
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贵州大学动物科学学院,贵阳550025;贵州省动物疫病研究室,贵阳550025;贵州大学动物科学学院,贵阳550025;贵州省动物疫病研究室,贵阳550025;贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室,
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为探究伴侣蛋白Hfq与GcvB及其靶基因oppA可能存在的关键作用位点,本研究通过λ-Red同源重组技术构建Hfq远端面和近端面核心氨基酸的突变菌株及Hfq C-端截短菌株,在此基础上构建相应的Hfq-His6标签蛋白标签融合菌株.运用P22噬菌体转导技术构建相应的GcvB基因缺失菌株以及oppA::lacZ基因融合菌株.通过Western blotting试验检测Hfq蛋白水平,实时荧光定量PCR检测GcvB和oppA基因转录水平,β-半乳糖苷酶试验检测oppA蛋白水平.Western blotting结果显示,Hfq远端面和近端面核心氨基酸的突变及Hfq C-端的截短均不同程度地上调了Hfq蛋白水平.实时荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,Hfq近端面核心氨基酸的突变使GcvB基因转录水平下调.β-半乳糖苷酶试验结果显示,与对照组相比,Hfq远端面和近端面核心氨基酸的突变及Hfq C-端的截短均未造成oppA基因转录水平的明显变化,但均不同程度地上调了oppA蛋白水平,其中Hfq近端面核心氨基酸突变及Hfq C-端分别截短至第65和72位氨基酸时oppA蛋白水平上调最为明显,分别上调了2.9、3.3和2.0倍.以上结果表明,Hfq近端面对于Hfq维持GcvB稳定性非常重要,Hfq近端面第56位氨基酸及Hfq C-端第65-87位氨基酸与oppA蛋白水平呈负相关.
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