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【摘要】 目的：探讨乌司他丁（UTI）预处理对SD大鼠颅脑损伤早期的神经保护作用及其机制。方法：选取雄性SD大鼠48只，随机分为假手术组（SO组）、乌司他丁预处理组（UTI组）、生理盐水对照组（Control组）和创伤性脑损伤组（TBI组）。分别给予UTI组和Control组连续3 d UTI 300 000 U/（kg·d）及等体积生理盐水腹腔注射。除SO组外，其余各组采用自由落体打击法建立创伤性脑损伤模型。打击后，采用改良的神经功能缺损评分评估四组大鼠的神经功能，干湿重法检测脑组织含水量，连续切片行HE染色后计算脑损伤的体积，经尾静脉采血用ELISA法检测血清S100B蛋白及NSE浓度变化。结果：UTI组颅脑损伤早期神经功能缺损评分、脑组织含水量及脑组织损伤体积均小于Control组（P<0.05），同时UTI组的血清S100B蛋白及NSE浓度均低于Control组（P<0.05），且UTI组、Control組及TBI组三组的血清S100B蛋白及NSE浓度均呈双峰变化。结论：乌司他丁预处理可降低实验大鼠颅脑损伤早期血清S100B蛋白及NSE浓度，减轻脑水肿及脑组织损伤体积，改善神经功能缺损，具有神经保护作用。
【关键词】 乌司他丁； 创伤性脑损伤； S100B； NSE
Protective Effect of Ulinastatin Pretreatment on Traumatic Brain Injury Rat Model/SHI Tao，GU Zhicheng，JIANG Guangyu，et al.//Medical Innovation of China，2018，15（08）：040-045
【Abstract】 Objective：To investigate the protective mechanism of Ulinastatin on traumatic brain injury rat model.Method：Forty-eight SD rats were randomly divided into four groups：sham operation group（SO group），NaCl control group（Control group），UTI pretreatment group（UTI group），and traumatic brain injury group（TBI group）.UTI group and Control group were given UTI 300 000 U/（kg·d） and the same volume of saline by intraperitoneal injection respectively.A closed TBI model was established by weight-drop device in the other groups except for SO group.The modified criteria of neurological defecting score was adopted to evaluate the nerve function of four groups.The wet-dry weighing method was used to detect the brain water content.The volume of brain injury was calculated after HE staining with serial section.The serum S100B protein and NSE from tail vein were detected by ELISA.Result：Compared with Control group，the score of neurological impairment，the water content，the volume of brain tissue defecting of UTI group were less（P<0.05）.The serum S100B protein and NSE concentration of UTI group were lower than those of Control group（P<0.05）.In addition，the serum S100B protein and NSE concentration in UTI group，Control group and TBI group showed a double peak change.Conclusion：Ulinastatin pretreatment will decrease the serum S100B protein and NSE concentration of the rats with traumatic brain injury in early stage，reduce cerebral edema，decrease the volume of brain tissue injury，improve nerve function defect and has a nerve protective effect.
【Key words】 Ulinastatin； Traumatic brain injury； S100B； NSE
First-author’s address：Graduate Department，Medical College of Jiamusi University，Jiamusi 154007，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.08.010 创伤性脑损伤（TBI）作为一种严重危及人体健康的疾病，发生率占全身各部位损伤的20%左右，尽管目前对其的救治水平已显著提高，但因伤及了中枢神经系统，其仍然是创伤死亡原因的第一位[1]。另外，颅脑手术作为一种可预见的损伤方式，正在各大医院普遍发生，能否通过术前给药增加脑组织对损伤的耐受性或减轻脑细胞的炎症反应、坏死及凋亡等一系列病理生理反应仍然值得广大医务工作者深入研究。
近年来国内外的研究显示，乌司他丁（Ulinastatin，UTI）作为一种广谱蛋白酶抑制剂，具有稳定细胞膜、溶酶体膜及免疫调节作用[2]，目前主要用于治疗急性胰腺炎、休克、调节免疫功能等[3]。同时它在中枢神经系统的作用越来越引起大家的重视，由于颅脑损伤和其他器官有不少相同的病理生理机制，推测UTI具有潜在的脑保护作用。有研究显示，神经生化标志物S100B蛋白及神经元烯醇化酶（Neuron Specific Enolase，NSE）分别高度特异性的存在于中枢神经系统的神经胶质细胞和神经元中，是目前最具有应用前景的颅脑损伤标志物[4]。本研究拟通过监测颅脑损伤大鼠血清S100B及NSE水平变化，结合神经功能评分、脑组织含水量及脑组织缺损体积等其他指标，观察UTI对颅脑损伤的脑保护作用。现报道如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组 选取成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠48只，清洁级，体重250～300 g，由佳木斯大学动物实验中心提供。随机分成假手术（sham operation，SO）组、创伤性脑损伤（TBI）组、乌司他丁预处理（UTI pretreatment，UTI）组和生理盐水对照（NaCl control，Control）组，每组12只。造模结束后SO组因麻醉死亡1只，UTI组死亡
2只，TBI组与Control组各死亡3只。
1.2 用药方法及模型制作 UTI组连续3 d给予UTI 300 000 U/（kg·d）腹腔注射后建立TBI模型。生理盐水对照组连续3 d给予0.9%NaCl腹腔注射后建立TBI模型。
参照Feeney等[5]自由落体颅脑损伤模型，室温条件下，2%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔内注射麻醉。麻醉成功后，俯卧位固定于底板上，固定头部，剪去顶毛并消毒，沿正中矢状线切开头皮，暴露右顶骨，用牙科钻在冠状缝后1.5 mm、中线旁开2.5 mm处钻一直径5 mm的骨窗，保持硬脑膜完整，将直径4.5 mm的圆锥形撞击端置于骨窗硬膜外，用20 g砝码由30 cm高度自由下落撞击撞击端，造成右顶叶脑挫裂伤，充分止血后，骨蜡封闭骨窗，碘伏消毒伤口后缝合头皮。将大鼠放置在保暖的加热箱内，维持大鼠的正常体温（37.0±0.5） ℃，麻醉自由落体复苏后放回饲养笼。假手术组除了没有撞击过程采用同样的麻醉及手术操作。
1.3 神经功能缺损评分 采用改良的神经功能缺损评分[6]对上述四组大鼠分别于6 h、12 h、24 h、3 d
进行神经功能的评估，评分标准分为大鼠的肢体运动、感觉、反射和平衡协调性等，评分范围在0～18分，分数越高表明神经功能缺损越严重。
1.4 采血检测血清S100B蛋白及NSE水平 各组分别于伤后6 h、12 h、24 h、3 d经尾静脉采血1 mL，全部标本在30 min内以2500 r/min离心10 min，取上层血清保存于-70 ℃低温冰箱备用统一检测。检测操作步骤完全按照说明书进行。
1.5 脑组织含水量的测定 分别在伤后24 h和3 d，从上述四组中各随机选取3只大鼠，断头取脑组织，用滤纸仔细吸净清除脑组织表面的血渍。沿矢状缝切开，区分两侧大脑半球，精密电子天平称湿重；置80 ℃烤箱中，连续烘烤48 h至恒重（最后两次质量差<0.2 mg）后称干重。按Elliott公式计算脑组织含水量（%）：脑组织含水量（%）=（湿重-干重）/湿重×100%。
1.6 脑组织固定、包埋后行石蜡切片 各组其余大鼠于伤后3 d全部断头去脑，注意仔细分离整个大脑组织，然后将脑组织置于4%多聚甲醛中固定2～3 d。经过梯度酒精脱水，二甲苯透明和浸蜡后进行包埋。包埋好的脑组织标本用切片机进行切片。从脑损伤区域前缘的1 mm开始切片，每隔300 μm切1张，每张厚度为4 μm，直到损伤区后缘。
1.7 脑损伤体积测定 石蜡切片完成后，行HE染色，染色完成后等待片子晾干后在Olympus BX51型荧光显微镜明场下拍照，将拍的照片用Imagetool软件处理，计算脑损伤的体积。损伤侧大脑半球及对侧大脑半球体积计算的方法按照公式
Σ（An+An+1）×d/2计算。其中A为相对应脑片的面积，n为用以计算切片的张数，d是相邻两个切片之间的距离（300 μm）。损伤体积=对侧大脑半球体积-损伤侧大脑半球的体积。
1.8 统计学处理 采用SPSS 20.0软件对所得数据进行统计分析，连续计量资料用（x±s）表示，两组比较采用Student’s t检验，多组间比较作单因素方差分析（One-way ANOVA），结合Newman.Keuls法检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大鼠神经功能缺损评分结果 创伤后6 h，SO組与UTI组、Control组、TBI组比较神经功能缺损评分较低（P<0.05），UTI组、Control组、TBI组三组比较差异无统计学意义（P>0.05），证明造模成功。创伤后12 h，UTI组、Control组、TBI组三组相互比较差异均无统计学意义（P>0.05），与创伤后6 h比较，组内差异均无统计学意义（P>0.05）。创伤后24 h，UTI组、Control组、TBI组三组神经功能缺损评分均下降，UTI组下降较明显，与Control组、TBI组比较差异均有统计学意义（P<0.05），Control组与TBI组比较差异无统计学意义（P>0.05），与创伤后12 h比较，UTI组、Control组、TBI组三组组内比较差异均有统计学意义（P<0.05）。创伤后3 d，UTI组、Control组、TBI组三组神经功能缺损评分均持续下降，UTI组与Control组及TBI组比较下降均较明显（P<0.05），Control组与TBI组比较差异无统计学意义（P>0.05），与创伤后6、12、24 h比较，UTI组、Control组、TBI组三组组内比较差异均有统计学意义（P<0.05）。SO组神经功能缺损评分在四个时间点组内比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见表1。 2.2 脑组织含水量的变化 创伤后24 h，UTI组、Control组、TBI组三组与SO组比较脑组织含水量均较高（P<0.05）。UTI组与Control组及TBI组比较脑组织含水量较低（P<0.05），Control组与TBI组比较差异无统计学意义（P>0.05）。创伤后3 d，UTI组、Control组、TBI组三组脑组织含水量均下降，与创伤后24 h比较，组内差异均有统计学意义（P<0.05）。UTI组与Control组及TBI组比较差异均有统计学意义（P<0.05）。Control组与TBI组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。
2.3 脑损伤体积结果 SO组脑组织无损伤，UTI组与Control组及TBI组比较脑组织损伤体积均较小（P<0.05），Control组与TBI组比较差异无统计学意义（P>0.05），见表2。
2.4 大鼠血清S100B蛋白水平的变化 创伤后6 h，UTI组、Control组、TBI组血清S100B含量与SO组比较均较高（P<0.05），UTI组与Control组及TBI组血清S100B含量均较低（均P<0.05），Control组与TBI组血清S100B含量比较差异无统计学意义（P>0.05）。创伤后12 h，UTI组、Control组、TBI组血清S100B含量较创伤后6 h呈下降趋势（P<0.05），UTI组与Control组及TBI组血清S100B含量均较低（P<0.05），Control组与TBI组血清S100B含量比较差异无统计学意义（P>0.05）。创伤后24 h，UTI组、Control组、TBI组血清S100B含量较创伤后12 h均呈持续下降（P<0.05），UTI组与Control组及TBI组血清S100B含量均较低（均P<0.05），Control组与TBI组血清S100B含量比较差异无统计学意义（P>0.05）。创伤后3 d，UTI组、Control组、TBI组血清S100B含量较创伤后24 h略高（P<0.05），UTI组与Control组及TBI组血清S100B含量均较低（P<0.05），Control组与TBI组血清S100B含量比较差异无统计学意义（P>0.05）。SO组血清S100B含量在四个时间点组内比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见表3。
2.5 大鼠血清NSE水平的变化 创伤后6 h，UTI组、Control组、TBI组血清NSE含量与SO组比较均较高（P<0.05），UTI组与Control组及TBI组血清NSE含量均较低（均P<0.05），Control组与TBI组比较血清NSE含量差异无统计学意义（P>0.05）。创伤后12 h，UTI组、Control组、TBI组血清NSE含量较创伤后6 h呈下降趋势（均P<0.05），UTI组与Control组及TBI组血清NSE含量较低（P<0.05），Control组与TBI组血清NSE含量比较差异无统计学意义（P>0.05）。创伤后24 h，UTI组、Control组、TBI组血清NSE含量较创伤后12 h呈持续下降（P<0.05），UTI组与Control组及TBI组血清NSE含量均较低（P<0.05），Control组与TBI组血清NSE含量比较差异无统计学意义（P>0.05）。创伤后3 d，UTI组、Control组、TBI组血清NSE含量较创伤后24 h略高（P<0.05），UTI组与Control组及TBI组血清NSE含量均较低（P<0.05），Control组与TBI组血清NSE含量比较差异无统计学意义（P>0.05）。SO组血清NSE含量在四个时间点组内比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表4。
3 讨论
近年来，随着我国机动车使用的迅猛增加，交通事故引起的以TBI为主的多发伤的比例也在逐年上升[7]。有研究显示，到2020年，TBI将超越其他疾病成为最主要的死亡及致残原因，其导致的死亡率、残疾率和功能障碍将成为公共健康的主要问题[8]。一般来说，TBI分原发性颅脑损伤和继发性颅脑损伤，前者指受伤的暴力所引起的头皮和颅骨伤，以及局部或广泛的神经血管伤；后者是在原发伤的基础上因缺血缺氧引起的脑水肿、脑疝及颅内出血等，而增加脑组织对损伤的耐受性或减少这些继发性损害即成为目前神经外科治疗研究的重点。目前研究TBI的模型可以分为细胞模型和动物模型两大类，考虑到细胞模型不能像动物模型很好的模拟TBI的真实发病过程，所以在本研究中，笔者用UTI对实验SD大鼠连续3 d腹腔注射后，采用Feeney式自由落体打击的方式制作动物TBI模型，该模型条件容易控制，设备造价相对便宜，其打击的力量通过改变下落物体的重量和调整下落物体的高度来实现，同时我们采用去除颅骨来减少偏差，制作中度TBI模型。造模后评估显示，造成的脑损伤的程度比较一致。
UTI是男性尿液中分离纯化的一种糖蛋白，含有143个氨基酸，具有两个活性功能区，是一种典型的Kuniz型蛋白酶抑制剂，两个活性功能区均有很广的抑酶谱，且不完全重叠，所以能够同时抑制胰蛋白酶、磷脂酶A2、透明质酸酶、弹性蛋白酶等多种水解酶的活性[9]；另外，UTI分解形成的低分子量成分也具有很强的抑制水解酶的作用[10]。研究表明，UTI有多种特殊的药理性质：除对多种蛋白酶、糖和脂水解酶有抑制作用外，还能抑制心肌抑制因子（MDF）的产生，改善休克时的循环状态，对溶酶体膜有稳定作用[11]。Li等[12]证明UTI能通过改善脾细胞增殖反应和细胞因子释放，促进免疫功能的恢复。Cao等[13]研究提示UTI在感染性结肠炎模型中抑制炎性因子的释放。在本研究中，在造模后24 h和3 d分别从SO组、UTI组、Control组及TBI组四组中各随机选取3只大鼠斷头取脑，测脑组织含水量，结果显示，UTI组SD大鼠在两个时间点的脑组织含水量均明显低于Control组（P<0.05），表明UTI可能减轻TBI后的继发性脑水肿。而脑水肿以及由此引起的颅内压的增高是造成TBI患者死亡的主要原因[14]。虽然在本次实验中，UTI组和Control组脑含水量的差别不是很大，但值得注意的是，TBI后脑含水量的轻度增高都会导致颅内压的显著增加和预后的变差。血脑屏障的破坏是导致TBI后脑水肿重要原因[15]。而在心脏骤停引起脑组织缺血再灌注损伤的动物模型中，UTI被证明可以通过减少一氧化氮的代谢产物而减少血脑屏障的破坏，从而减少大脑皮层神经元的死亡[16]。因此，笔者推测，UTI有可能通过保护血脑屏障的破坏而减轻了TBI后的脑水肿。另外，本研究采用HE染色来评估脑损伤的体积，结果显示，UTI组SD大鼠在受打击后3 d的脑组织缺损体积明显小于Control组（P<0.05），这表明UTI减轻了脑组织的损伤，在TBI后脑组织的修复过程中可能也发挥了重要的作用。同时，在大鼠受打击后6 h、12 h、24 h、3 d分别对四组大鼠从肢体运动、感觉、反射和平衡协调性等方面进行神经功能缺损评分，结果表明，UTI组和Control组神经功能缺损评分在伤后24 d和3 d存在着明显差异（P<0.05），笔者推测这可能与UTI降低脑水肿，减少脑损伤体积有关。 目前，中枢神经系统损伤的确诊大部分依赖于临床表现及临床影像学资料，而颅脑损伤后对损伤程度的定量评估以及疾病转归、早期预测已成为临床关注的热点，相关生物标志物的筛选研究是其中的一个重要方面。理想的脑损伤生物标志物应具有高度的特异性和敏感性，同时具有伤后立即释放、伤后早期即可检出和可快速检测等特点，已有报道许多蛋白质、小分子物质及脂质分子可作为判断TBI脑损伤可行的生物学指标，而S100B蛋白和NSE是其中较为经典且研究较多两种。S100B蛋白是一种小分子量酸性钙结合蛋白，高浓度存在于神经胶质细胞和中枢周围神经系统的施旺细胞和朗格汉斯细胞以及垂体前叶细胞内，主要存在于中枢神经系统中，大多数由星形胶质细胞合成和分泌。S100B蛋白是神经系统的特异性脑功能蛋白，具有营养神经细胞，参与细胞能量代谢及信号传导等作用[17]。正常成人血清中S100B蛋白含量较小，通常较难测出。S100B蛋白在脑缺氧缺氧损伤后
20 min，血清S100B蛋白即可达到峰值。这一变化是因为低氧使胶质细胞的细胞膜完整性遭到破坏，释放S100B蛋白进入脑脊液，同时缺氧还造成血脑屏障受损，通透性增高，使S100B蛋白通过血脑屏障进入血液，血清中蛋白浓度迅速升高[18]。Chabok等[19]认为血清中检测到S100B蛋白也是血脑屏障受损的标志。NSE是一种由亚基组成的烯醇化酶二聚体同工酶，特异性地存在于神经元和神经内分泌细胞中，其含量约占脑全部可溶性蛋白的1.5%，周围神经NSE的含量远远低于脑内[20]。正常血液中NSE含量极低，人体研究显示，当缺血、缺氧时，NSE从受损崩解的神经元细胞内释放出来，通过已破坏的血脑屏障进入血液循环系统中[21]。NSE不与细胞内肌动蛋白结合，血清NSE含量和脑损伤严重程度呈正相关，损伤越严重，血清NSE含量越高[22]。在本研究中，分别于伤后6 h、12 h、24 h、3 d四个时间点对四组大鼠采血进行血清S100B及NSE浓度检测。结果显示，在打击后6 h，TBI组血清S100B及NSE浓度即较SO组大幅增高，表明打击作用导致了实验大鼠血清S100B及NSE含量急剧增加，反过来也提示血清S100B及NSE浓度的变化可以反映大鼠颅脑受损情况。随着大鼠神经功能缺损评分降低，血清S100B及NSE浓度也在降低，提示血清S100B及NSE浓度与神经受损呈正相关性。通过比较UTI组与Control组血清S100B及NSE浓度发现，UTI组血清S100B及NSE浓度在伤后6 h、12 h、24 h、
3 d四个时间点均明显低于Control组（P<0.05）。结合S100B及NSE在人體存在的部位及释放特点，推测乌司他丁可以通过保护胶质细胞及神经元细胞膜完整性、促进血脑屏障修复等降低血清S100B及NSE浓度。从伤后6～24 h，大鼠血清S100B及NSE浓度呈持续下降的趋势，但在伤后3 d，大鼠血清S100B及NSE浓度较伤后24 h有所上升，呈现一个双峰的波形，推测这可能与继发性TBI导致脑组织进一步受损，增加了胶质细胞、神经元细胞细胞膜及血脑屏障的破坏，从而增加了S100B蛋白及NSE血清的释放。结合上述的文献，笔者认为乌司他丁可能通过清除体内氧自由基、减少炎症因子的释放，调控细胞内外渗透压，维持细胞内外水和电解质平衡，减轻脑水肿的发生和程度，从而减少细胞死亡，保护受损脑组织，减缓TBI的发生和发展。
综上所述，乌司他丁腹腔注射能够降低TBI的脑水肿、减少脑损伤体积、改善TBI神经功能缺损及降低实验大鼠血清S100B及NSE浓度，具有神经保护的作用。
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（收稿日期：2017-12-04） （本文编辑：程旭然）
【关键词】 乌司他丁； 创伤性脑损伤； S100B； NSE
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【Key words】 Ulinastatin； Traumatic brain injury； S100B； NSE
First-author’s address：Graduate Department，Medical College of Jiamusi University，Jiamusi 154007，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.08.010 创伤性脑损伤（TBI）作为一种严重危及人体健康的疾病，发生率占全身各部位损伤的20%左右，尽管目前对其的救治水平已显著提高，但因伤及了中枢神经系统，其仍然是创伤死亡原因的第一位[1]。另外，颅脑手术作为一种可预见的损伤方式，正在各大医院普遍发生，能否通过术前给药增加脑组织对损伤的耐受性或减轻脑细胞的炎症反应、坏死及凋亡等一系列病理生理反应仍然值得广大医务工作者深入研究。
近年来国内外的研究显示，乌司他丁（Ulinastatin，UTI）作为一种广谱蛋白酶抑制剂，具有稳定细胞膜、溶酶体膜及免疫调节作用[2]，目前主要用于治疗急性胰腺炎、休克、调节免疫功能等[3]。同时它在中枢神经系统的作用越来越引起大家的重视，由于颅脑损伤和其他器官有不少相同的病理生理机制，推测UTI具有潜在的脑保护作用。有研究显示，神经生化标志物S100B蛋白及神经元烯醇化酶（Neuron Specific Enolase，NSE）分别高度特异性的存在于中枢神经系统的神经胶质细胞和神经元中，是目前最具有应用前景的颅脑损伤标志物[4]。本研究拟通过监测颅脑损伤大鼠血清S100B及NSE水平变化，结合神经功能评分、脑组织含水量及脑组织缺损体积等其他指标，观察UTI对颅脑损伤的脑保护作用。现报道如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组 选取成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠48只，清洁级，体重250～300 g，由佳木斯大学动物实验中心提供。随机分成假手术（sham operation，SO）组、创伤性脑损伤（TBI）组、乌司他丁预处理（UTI pretreatment，UTI）组和生理盐水对照（NaCl control，Control）组，每组12只。造模结束后SO组因麻醉死亡1只，UTI组死亡
2只，TBI组与Control组各死亡3只。
1.2 用药方法及模型制作 UTI组连续3 d给予UTI 300 000 U/（kg·d）腹腔注射后建立TBI模型。生理盐水对照组连续3 d给予0.9%NaCl腹腔注射后建立TBI模型。
参照Feeney等[5]自由落体颅脑损伤模型，室温条件下，2%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔内注射麻醉。麻醉成功后，俯卧位固定于底板上，固定头部，剪去顶毛并消毒，沿正中矢状线切开头皮，暴露右顶骨，用牙科钻在冠状缝后1.5 mm、中线旁开2.5 mm处钻一直径5 mm的骨窗，保持硬脑膜完整，将直径4.5 mm的圆锥形撞击端置于骨窗硬膜外，用20 g砝码由30 cm高度自由下落撞击撞击端，造成右顶叶脑挫裂伤，充分止血后，骨蜡封闭骨窗，碘伏消毒伤口后缝合头皮。将大鼠放置在保暖的加热箱内，维持大鼠的正常体温（37.0±0.5） ℃，麻醉自由落体复苏后放回饲养笼。假手术组除了没有撞击过程采用同样的麻醉及手术操作。
1.3 神经功能缺损评分 采用改良的神经功能缺损评分[6]对上述四组大鼠分别于6 h、12 h、24 h、3 d
进行神经功能的评估，评分标准分为大鼠的肢体运动、感觉、反射和平衡协调性等，评分范围在0～18分，分数越高表明神经功能缺损越严重。
1.4 采血检测血清S100B蛋白及NSE水平 各组分别于伤后6 h、12 h、24 h、3 d经尾静脉采血1 mL，全部标本在30 min内以2500 r/min离心10 min，取上层血清保存于-70 ℃低温冰箱备用统一检测。检测操作步骤完全按照说明书进行。
1.5 脑组织含水量的测定 分别在伤后24 h和3 d，从上述四组中各随机选取3只大鼠，断头取脑组织，用滤纸仔细吸净清除脑组织表面的血渍。沿矢状缝切开，区分两侧大脑半球，精密电子天平称湿重；置80 ℃烤箱中，连续烘烤48 h至恒重（最后两次质量差<0.2 mg）后称干重。按Elliott公式计算脑组织含水量（%）：脑组织含水量（%）=（湿重-干重）/湿重×100%。
1.6 脑组织固定、包埋后行石蜡切片 各组其余大鼠于伤后3 d全部断头去脑，注意仔细分离整个大脑组织，然后将脑组织置于4%多聚甲醛中固定2～3 d。经过梯度酒精脱水，二甲苯透明和浸蜡后进行包埋。包埋好的脑组织标本用切片机进行切片。从脑损伤区域前缘的1 mm开始切片，每隔300 μm切1张，每张厚度为4 μm，直到损伤区后缘。
1.7 脑损伤体积测定 石蜡切片完成后，行HE染色，染色完成后等待片子晾干后在Olympus BX51型荧光显微镜明场下拍照，将拍的照片用Imagetool软件处理，计算脑损伤的体积。损伤侧大脑半球及对侧大脑半球体积计算的方法按照公式
Σ（An+An+1）×d/2计算。其中A为相对应脑片的面积，n为用以计算切片的张数，d是相邻两个切片之间的距离（300 μm）。损伤体积=对侧大脑半球体积-损伤侧大脑半球的体积。
1.8 统计学处理 采用SPSS 20.0软件对所得数据进行统计分析，连续计量资料用（x±s）表示，两组比较采用Student’s t检验，多组间比较作单因素方差分析（One-way ANOVA），结合Newman.Keuls法检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大鼠神经功能缺损评分结果 创伤后6 h，SO組与UTI组、Control组、TBI组比较神经功能缺损评分较低（P<0.05），UTI组、Control组、TBI组三组比较差异无统计学意义（P>0.05），证明造模成功。创伤后12 h，UTI组、Control组、TBI组三组相互比较差异均无统计学意义（P>0.05），与创伤后6 h比较，组内差异均无统计学意义（P>0.05）。创伤后24 h，UTI组、Control组、TBI组三组神经功能缺损评分均下降，UTI组下降较明显，与Control组、TBI组比较差异均有统计学意义（P<0.05），Control组与TBI组比较差异无统计学意义（P>0.05），与创伤后12 h比较，UTI组、Control组、TBI组三组组内比较差异均有统计学意义（P<0.05）。创伤后3 d，UTI组、Control组、TBI组三组神经功能缺损评分均持续下降，UTI组与Control组及TBI组比较下降均较明显（P<0.05），Control组与TBI组比较差异无统计学意义（P>0.05），与创伤后6、12、24 h比较，UTI组、Control组、TBI组三组组内比较差异均有统计学意义（P<0.05）。SO组神经功能缺损评分在四个时间点组内比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见表1。 2.2 脑组织含水量的变化 创伤后24 h，UTI组、Control组、TBI组三组与SO组比较脑组织含水量均较高（P<0.05）。UTI组与Control组及TBI组比较脑组织含水量较低（P<0.05），Control组与TBI组比较差异无统计学意义（P>0.05）。创伤后3 d，UTI组、Control组、TBI组三组脑组织含水量均下降，与创伤后24 h比较，组内差异均有统计学意义（P<0.05）。UTI组与Control组及TBI组比较差异均有统计学意义（P<0.05）。Control组与TBI组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。
2.3 脑损伤体积结果 SO组脑组织无损伤，UTI组与Control组及TBI组比较脑组织损伤体积均较小（P<0.05），Control组与TBI组比较差异无统计学意义（P>0.05），见表2。
2.4 大鼠血清S100B蛋白水平的变化 创伤后6 h，UTI组、Control组、TBI组血清S100B含量与SO组比较均较高（P<0.05），UTI组与Control组及TBI组血清S100B含量均较低（均P<0.05），Control组与TBI组血清S100B含量比较差异无统计学意义（P>0.05）。创伤后12 h，UTI组、Control组、TBI组血清S100B含量较创伤后6 h呈下降趋势（P<0.05），UTI组与Control组及TBI组血清S100B含量均较低（P<0.05），Control组与TBI组血清S100B含量比较差异无统计学意义（P>0.05）。创伤后24 h，UTI组、Control组、TBI组血清S100B含量较创伤后12 h均呈持续下降（P<0.05），UTI组与Control组及TBI组血清S100B含量均较低（均P<0.05），Control组与TBI组血清S100B含量比较差异无统计学意义（P>0.05）。创伤后3 d，UTI组、Control组、TBI组血清S100B含量较创伤后24 h略高（P<0.05），UTI组与Control组及TBI组血清S100B含量均较低（P<0.05），Control组与TBI组血清S100B含量比较差异无统计学意义（P>0.05）。SO组血清S100B含量在四个时间点组内比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见表3。
2.5 大鼠血清NSE水平的变化 创伤后6 h，UTI组、Control组、TBI组血清NSE含量与SO组比较均较高（P<0.05），UTI组与Control组及TBI组血清NSE含量均较低（均P<0.05），Control组与TBI组比较血清NSE含量差异无统计学意义（P>0.05）。创伤后12 h，UTI组、Control组、TBI组血清NSE含量较创伤后6 h呈下降趋势（均P<0.05），UTI组与Control组及TBI组血清NSE含量较低（P<0.05），Control组与TBI组血清NSE含量比较差异无统计学意义（P>0.05）。创伤后24 h，UTI组、Control组、TBI组血清NSE含量较创伤后12 h呈持续下降（P<0.05），UTI组与Control组及TBI组血清NSE含量均较低（P<0.05），Control组与TBI组血清NSE含量比较差异无统计学意义（P>0.05）。创伤后3 d，UTI组、Control组、TBI组血清NSE含量较创伤后24 h略高（P<0.05），UTI组与Control组及TBI组血清NSE含量均较低（P<0.05），Control组与TBI组血清NSE含量比较差异无统计学意义（P>0.05）。SO组血清NSE含量在四个时间点组内比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表4。
3 讨论
近年来，随着我国机动车使用的迅猛增加，交通事故引起的以TBI为主的多发伤的比例也在逐年上升[7]。有研究显示，到2020年，TBI将超越其他疾病成为最主要的死亡及致残原因，其导致的死亡率、残疾率和功能障碍将成为公共健康的主要问题[8]。一般来说，TBI分原发性颅脑损伤和继发性颅脑损伤，前者指受伤的暴力所引起的头皮和颅骨伤，以及局部或广泛的神经血管伤；后者是在原发伤的基础上因缺血缺氧引起的脑水肿、脑疝及颅内出血等，而增加脑组织对损伤的耐受性或减少这些继发性损害即成为目前神经外科治疗研究的重点。目前研究TBI的模型可以分为细胞模型和动物模型两大类，考虑到细胞模型不能像动物模型很好的模拟TBI的真实发病过程，所以在本研究中，笔者用UTI对实验SD大鼠连续3 d腹腔注射后，采用Feeney式自由落体打击的方式制作动物TBI模型，该模型条件容易控制，设备造价相对便宜，其打击的力量通过改变下落物体的重量和调整下落物体的高度来实现，同时我们采用去除颅骨来减少偏差，制作中度TBI模型。造模后评估显示，造成的脑损伤的程度比较一致。
UTI是男性尿液中分离纯化的一种糖蛋白，含有143个氨基酸，具有两个活性功能区，是一种典型的Kuniz型蛋白酶抑制剂，两个活性功能区均有很广的抑酶谱，且不完全重叠，所以能够同时抑制胰蛋白酶、磷脂酶A2、透明质酸酶、弹性蛋白酶等多种水解酶的活性[9]；另外，UTI分解形成的低分子量成分也具有很强的抑制水解酶的作用[10]。研究表明，UTI有多种特殊的药理性质：除对多种蛋白酶、糖和脂水解酶有抑制作用外，还能抑制心肌抑制因子（MDF）的产生，改善休克时的循环状态，对溶酶体膜有稳定作用[11]。Li等[12]证明UTI能通过改善脾细胞增殖反应和细胞因子释放，促进免疫功能的恢复。Cao等[13]研究提示UTI在感染性结肠炎模型中抑制炎性因子的释放。在本研究中，在造模后24 h和3 d分别从SO组、UTI组、Control组及TBI组四组中各随机选取3只大鼠斷头取脑，测脑组织含水量，结果显示，UTI组SD大鼠在两个时间点的脑组织含水量均明显低于Control组（P<0.05），表明UTI可能减轻TBI后的继发性脑水肿。而脑水肿以及由此引起的颅内压的增高是造成TBI患者死亡的主要原因[14]。虽然在本次实验中，UTI组和Control组脑含水量的差别不是很大，但值得注意的是，TBI后脑含水量的轻度增高都会导致颅内压的显著增加和预后的变差。血脑屏障的破坏是导致TBI后脑水肿重要原因[15]。而在心脏骤停引起脑组织缺血再灌注损伤的动物模型中，UTI被证明可以通过减少一氧化氮的代谢产物而减少血脑屏障的破坏，从而减少大脑皮层神经元的死亡[16]。因此，笔者推测，UTI有可能通过保护血脑屏障的破坏而减轻了TBI后的脑水肿。另外，本研究采用HE染色来评估脑损伤的体积，结果显示，UTI组SD大鼠在受打击后3 d的脑组织缺损体积明显小于Control组（P<0.05），这表明UTI减轻了脑组织的损伤，在TBI后脑组织的修复过程中可能也发挥了重要的作用。同时，在大鼠受打击后6 h、12 h、24 h、3 d分别对四组大鼠从肢体运动、感觉、反射和平衡协调性等方面进行神经功能缺损评分，结果表明，UTI组和Control组神经功能缺损评分在伤后24 d和3 d存在着明显差异（P<0.05），笔者推测这可能与UTI降低脑水肿，减少脑损伤体积有关。 目前，中枢神经系统损伤的确诊大部分依赖于临床表现及临床影像学资料，而颅脑损伤后对损伤程度的定量评估以及疾病转归、早期预测已成为临床关注的热点，相关生物标志物的筛选研究是其中的一个重要方面。理想的脑损伤生物标志物应具有高度的特异性和敏感性，同时具有伤后立即释放、伤后早期即可检出和可快速检测等特点，已有报道许多蛋白质、小分子物质及脂质分子可作为判断TBI脑损伤可行的生物学指标，而S100B蛋白和NSE是其中较为经典且研究较多两种。S100B蛋白是一种小分子量酸性钙结合蛋白，高浓度存在于神经胶质细胞和中枢周围神经系统的施旺细胞和朗格汉斯细胞以及垂体前叶细胞内，主要存在于中枢神经系统中，大多数由星形胶质细胞合成和分泌。S100B蛋白是神经系统的特异性脑功能蛋白，具有营养神经细胞，参与细胞能量代谢及信号传导等作用[17]。正常成人血清中S100B蛋白含量较小，通常较难测出。S100B蛋白在脑缺氧缺氧损伤后
20 min，血清S100B蛋白即可达到峰值。这一变化是因为低氧使胶质细胞的细胞膜完整性遭到破坏，释放S100B蛋白进入脑脊液，同时缺氧还造成血脑屏障受损，通透性增高，使S100B蛋白通过血脑屏障进入血液，血清中蛋白浓度迅速升高[18]。Chabok等[19]认为血清中检测到S100B蛋白也是血脑屏障受损的标志。NSE是一种由亚基组成的烯醇化酶二聚体同工酶，特异性地存在于神经元和神经内分泌细胞中，其含量约占脑全部可溶性蛋白的1.5%，周围神经NSE的含量远远低于脑内[20]。正常血液中NSE含量极低，人体研究显示，当缺血、缺氧时，NSE从受损崩解的神经元细胞内释放出来，通过已破坏的血脑屏障进入血液循环系统中[21]。NSE不与细胞内肌动蛋白结合，血清NSE含量和脑损伤严重程度呈正相关，损伤越严重，血清NSE含量越高[22]。在本研究中，分别于伤后6 h、12 h、24 h、3 d四个时间点对四组大鼠采血进行血清S100B及NSE浓度检测。结果显示，在打击后6 h，TBI组血清S100B及NSE浓度即较SO组大幅增高，表明打击作用导致了实验大鼠血清S100B及NSE含量急剧增加，反过来也提示血清S100B及NSE浓度的变化可以反映大鼠颅脑受损情况。随着大鼠神经功能缺损评分降低，血清S100B及NSE浓度也在降低，提示血清S100B及NSE浓度与神经受损呈正相关性。通过比较UTI组与Control组血清S100B及NSE浓度发现，UTI组血清S100B及NSE浓度在伤后6 h、12 h、24 h、
3 d四个时间点均明显低于Control组（P<0.05）。结合S100B及NSE在人體存在的部位及释放特点，推测乌司他丁可以通过保护胶质细胞及神经元细胞膜完整性、促进血脑屏障修复等降低血清S100B及NSE浓度。从伤后6～24 h，大鼠血清S100B及NSE浓度呈持续下降的趋势，但在伤后3 d，大鼠血清S100B及NSE浓度较伤后24 h有所上升，呈现一个双峰的波形，推测这可能与继发性TBI导致脑组织进一步受损，增加了胶质细胞、神经元细胞细胞膜及血脑屏障的破坏，从而增加了S100B蛋白及NSE血清的释放。结合上述的文献，笔者认为乌司他丁可能通过清除体内氧自由基、减少炎症因子的释放，调控细胞内外渗透压，维持细胞内外水和电解质平衡，减轻脑水肿的发生和程度，从而减少细胞死亡，保护受损脑组织，减缓TBI的发生和发展。
综上所述，乌司他丁腹腔注射能够降低TBI的脑水肿、减少脑损伤体积、改善TBI神经功能缺损及降低实验大鼠血清S100B及NSE浓度，具有神经保护的作用。
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（收稿日期：2017-12-04） （本文编辑：程旭然）