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摘要 [目的]探讨阿育魏果中总黄酮的提取方法及含量测定方法。[方法]采用正交试验，以提取的总黄酮的含量为评价指标，紫外可见分光光度法测定总黄酮含量。[结果]超声法提取阿育魏果中总黄酮的含量为10.378%，相对标准偏差为2.38%（n=3）。最优工艺如下：时间为15 min，功率为150 W，料液比为1∶20，乙醇浓度为70%。上述4个因素对阿育魏果中总黄酮提取率的影响从大到小依次为乙醇浓度、料液比、超声功率和超声时间。[结论]超声提取阿育魏果中总黄酮快速且高效；紫外外分光光度法准确度较高，偏差较小。
关键词 阿育魏果；总黄酮；正交试验；紫外可见分光光度法；超声提取
Determination of Extraction Process of Total Flavonoids in Seed of Trachyspermum ammi （L.） Sprague of Uyghur Crude Drug
MUAITAER·Nuermaimaiti1，XIAMUXINUER·Aikebaier1，TAILIAITI·Tuerhong1，LIU Yong-gang2* （1. College of Xinjiang Uyghur Medicine，Hetian，Xinjiang 848000；2. Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102）
Abstract [Objective] The aim was to study the methods of extraction and determination of total flavonoids in seed of Trachyspermum ammi （L.） Sprague. [Method] Through orthogonal experiments and taking total flavonoids extracted as the evaluation index，UV-Vis spectrophotometry method was used to determine the optimum technological conditions of total flavonoids extraction in seed of Trachyspermum ammi （L.） Sprague. [Result] The total flavonoids content measured in seed of Trachyspermum ammi （L.） Sprague was 10.378%，and the relative standard deviation was 2.38% （n=3）. The best ultrasonic extraction technology of total flavonoids was as followed：the ultrasonic time was 15 min； the ultrasonic power was 150 W； the solid-liquid ratio was 1∶20； and the concentration of ethanol was 70%. The effects of the four factors was in order of ethanol concentration，solid-liquid ratio，ultrasonic power and ultrasonic time. [Conclusion] The ultrasonic extraction techniques of total flavonoids from seed of Trachyspermum ammi （L.） Sprague are quick and efficien. The UV-Vis spectrophotometry method is accurate and reliable.
Key words Seed of Trachyspermum ammi （L.） Sprague；Total flavonoids；Orthogonal experiments；UV-Vis spectrophotometry method；Ultrasonic extraction
阿育魏果，维吾尔语称“Juwine”，音译为“居维纳”，汉语通用名为“阿育魏果”，为伞形科植物细叶糙果芹[Trachyspermum ammi （L.）Sprague.]的成熟果实[1-2]。阿育魏果作为维吾尔常用药材，被收录于《卫生部药品标准：维吾尔要分册》[3]。阿育魏果中总黄酮具有体外抗氧化活性，因此可作为新型天然抗氧化物质的来源[4]。阿育魏果总黄酮抗氧化活性研究已见报道[4]，但未见总黄酮含量测定的相关报道。超声提取技术在医药、化学等各领域，尤其在药材成分提取中作用日益重要[5]。笔者采用超声波提取法和正交试验，以芦丁为对照品，通过紫外分光光度法对阿育魏果中总黄酮提取进行了优化，旨在为阿育魏果的质量标准研究及开发利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料 阿育魏果购自新疆和田，由木艾塔尔·努尔麦麦提鉴定；芦丁标准品由中国药品生物制品检定所提供，批号为100080-200707；无水乙醇；蒸馏水；其余试剂均为分析纯。
2802型紫外可见分光光度计，上海尤尼柯仪器有限公司；KQ5200DE型数控超声波清洗器，江苏省昆山市超声仪器有限公司。
1.2 方法 黃酮类物质含量测定，以芦丁为标准品，采用分光光度法进行测定[6]。
1.2.1 对照品溶液的制备。 称取芦丁50.0 mg，置于25 mL量瓶中，加适量甲醇溶解，定容。量取10 mL，置于100 mL量瓶中，加水定容，得0.2 mg/mL标准液。
1.2.2 标准曲线的绘制。
量取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL对照品溶液置于25 mL容量瓶中，制成系列标准溶液。分别加入5% NaNO2溶液1.0 mL，混匀，放置6 min，加入1.0 mL 10% Al（NO）3溶液，混匀，放置6 min，再加入10.0 mL 5% NaOH，用蒸馏水定容，摇匀，放置15 min。以相应的试剂为空白，在510 nm波长处测定吸光度，以标准芦丁浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制曲线。
1.2.3 正交试验。
通过预试验确定超声提取法条件，按照L9（34）设计4因素3水平的正交试验。称取阿育魏果样品1.0 g若干份，置于锥形瓶中，加入提取溶剂超声提取数分钟，过滤，取1.0 mL提取液进行显色反应，测定提取物中黄酮含量及提取率。选取时间（A）、功率（B）、料液比（C）、乙醇浓度（D）4个因素进行正交试验。超声波提取法因素及水平见表1。
1.2.4 数据处理。样品中的黄酮含量 （以芦丁计）=（C×V1×V3/W×V2）×100%，式中，C为样液含黄酮量（mg/mL）；V1为提取总体积（mL）；V2为显色时抽取体积（mL）；V3为显色时定容体积（mL）；W为称样重量（g）。
2 结果与分析
2.1 线性关系的考察 以标准芦丁浓度（8.00～48.00 μg/mL）为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得出线性方程（图1）：y=12.71x+0.002 7，R2=0.999 4，线性关系良好。
2.2 方法学考察
2.2.1 精密度考察。
量取对照溶液6份，每份1.0 mL，置于
25 mL量瓶中，按“1.2.2”顯色方法显色并测定吸光度，通过回归方程计算总黄酮含量。相对标准偏差为0.21%，表明精密度良好。
2.2.2 稳定性考察。
量取同一供试溶液6份，按“1.2.2”显色方法显色，在510 nm波长处每隔5 min测定吸光度1次，测定60 min。结果显示，供试溶液在30 min内的吸光度稳定，相对标准偏差为2.85%，而30 min后其吸光度下降明显，表明供试溶液在30 min内的稳定性良好。
2.2.3 重复性考察。
称取样品6份，按“1.2.2”显色方法显色并测定吸光度，计算其含量，相对标准偏差为2.77%，表明该方法重复性良好。
2.2.4 加样回收试验。
量取已知总黄酮含量的提取液6份，分别加入已知浓度的芦丁标准品溶液，按“1.2.2”项操作显色，在510 nm波长处测定吸光度，得出总黄酮含量，根据回收率公式计算出加样回收率。由表2可知，回收率在98.95%～107.09%，平均回收率为101.17%，相对标准偏差为2.92%。
2.3 正交试验结果
正交试验结果（表3）显示，乙醇浓度（D）对总黄酮提取效果的影响最大，料液比（C）和超声功率（B）影响依次减小，超声时间（A）的影响最小。最佳提取工艺组合为A2B2C3D1，即阿育魏果中总黄酮的最佳提取工艺
条件：超声时间为15 min，功率为150 W，料液比为1∶20，乙醇浓度为70%。
2.4 阿育魏果总黄酮提取率的测定 在“2.3”确定的最佳提取工艺条件下对阿育魏果进行超声提取，提取液按“1.2.2”进行总黄酮含量测定，平行试验3次。结果表明，总黄酮含量为10.078%，相对标准偏差为2.38%。
3 结论与讨论
目前，维吾尔药国家和地方标准体系已初步建立，基本保证了维吾尔医临床需求和质量，但仍有25.2%[7]的维吾尔药材没有质量标准，所以维吾尔药的质量标准亟需健全和完善。其中，总黄酮含量测定方法的考察一直是总黄酮研究的一个重要部分。该研究以药典为标准进行初步探讨，根据多次试验结果得出维吾尔药阿育魏果的最佳超声提取工艺：超声时间为15 min，功率为150 W，料液比为1∶20，乙醇浓度为70%。其操作方法简单常用，重复性、精密度、加样回收率均较好。超声提取法有助于节省提取溶剂并缩短提取时间。
此外，可通过石油醚脱脂脱色脱蜡、萃取等[8-9]工艺进一步提高提取含量，达到进一步优化的目的。
参考文献
[1] 中国医学百科全书编辑委员会.中国医学百科全书维吾尔医学[M].上海：上海科学技术出版社，2005：235.
[2] 新疆植物志编辑委员会.新疆植物志[M].乌鲁木齐：新疆科学技术出版社，2011：521-524.
[3] 中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准维吾尔药分册[M].乌鲁木齐：新疆科技卫生出版社，1999：42.
[4] 张慧，章立华，黄琼，等.维药阿育魏实总黄酮抗氧化活性研究[J].安徽农业科学，2014，42（15）：4624-4625，4639.
[5] 邬方宁.超声提取技术在现代中药中的应用[J].中草药，2007，38（2）：315-316.
[6] 国家药典委员会.中国药典：一部[M].北京：化学工业出版，2010：333.
[7] 苏来曼·哈力克，孙磊，吴光翠，等.维吾尔药质量标准现状分析及发展建议[J].中国药事，2015，29（12）：1256-1262.
[8] 陈建平，王金辉，王艳杰，等.蒙药瞿麦中总黄酮超声提取工艺研究及含量测定[J].中华中医药杂志，2013，28（9）：2580-2584.
[9] 曲中堂，王光利，项昭保，等.青果总黄酮的含量测定及超声提取工艺研究[J].食品工业科技，2012，33（7）：291-293.
关键词 阿育魏果；总黄酮；正交试验；紫外可见分光光度法；超声提取
Determination of Extraction Process of Total Flavonoids in Seed of Trachyspermum ammi （L.） Sprague of Uyghur Crude Drug
MUAITAER·Nuermaimaiti1，XIAMUXINUER·Aikebaier1，TAILIAITI·Tuerhong1，LIU Yong-gang2* （1. College of Xinjiang Uyghur Medicine，Hetian，Xinjiang 848000；2. Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102）
Abstract [Objective] The aim was to study the methods of extraction and determination of total flavonoids in seed of Trachyspermum ammi （L.） Sprague. [Method] Through orthogonal experiments and taking total flavonoids extracted as the evaluation index，UV-Vis spectrophotometry method was used to determine the optimum technological conditions of total flavonoids extraction in seed of Trachyspermum ammi （L.） Sprague. [Result] The total flavonoids content measured in seed of Trachyspermum ammi （L.） Sprague was 10.378%，and the relative standard deviation was 2.38% （n=3）. The best ultrasonic extraction technology of total flavonoids was as followed：the ultrasonic time was 15 min； the ultrasonic power was 150 W； the solid-liquid ratio was 1∶20； and the concentration of ethanol was 70%. The effects of the four factors was in order of ethanol concentration，solid-liquid ratio，ultrasonic power and ultrasonic time. [Conclusion] The ultrasonic extraction techniques of total flavonoids from seed of Trachyspermum ammi （L.） Sprague are quick and efficien. The UV-Vis spectrophotometry method is accurate and reliable.
Key words Seed of Trachyspermum ammi （L.） Sprague；Total flavonoids；Orthogonal experiments；UV-Vis spectrophotometry method；Ultrasonic extraction
阿育魏果，维吾尔语称“Juwine”，音译为“居维纳”，汉语通用名为“阿育魏果”，为伞形科植物细叶糙果芹[Trachyspermum ammi （L.）Sprague.]的成熟果实[1-2]。阿育魏果作为维吾尔常用药材，被收录于《卫生部药品标准：维吾尔要分册》[3]。阿育魏果中总黄酮具有体外抗氧化活性，因此可作为新型天然抗氧化物质的来源[4]。阿育魏果总黄酮抗氧化活性研究已见报道[4]，但未见总黄酮含量测定的相关报道。超声提取技术在医药、化学等各领域，尤其在药材成分提取中作用日益重要[5]。笔者采用超声波提取法和正交试验，以芦丁为对照品，通过紫外分光光度法对阿育魏果中总黄酮提取进行了优化，旨在为阿育魏果的质量标准研究及开发利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料 阿育魏果购自新疆和田，由木艾塔尔·努尔麦麦提鉴定；芦丁标准品由中国药品生物制品检定所提供，批号为100080-200707；无水乙醇；蒸馏水；其余试剂均为分析纯。
2802型紫外可见分光光度计，上海尤尼柯仪器有限公司；KQ5200DE型数控超声波清洗器，江苏省昆山市超声仪器有限公司。
1.2 方法 黃酮类物质含量测定，以芦丁为标准品，采用分光光度法进行测定[6]。
1.2.1 对照品溶液的制备。 称取芦丁50.0 mg，置于25 mL量瓶中，加适量甲醇溶解，定容。量取10 mL，置于100 mL量瓶中，加水定容，得0.2 mg/mL标准液。
1.2.2 标准曲线的绘制。
量取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL对照品溶液置于25 mL容量瓶中，制成系列标准溶液。分别加入5% NaNO2溶液1.0 mL，混匀，放置6 min，加入1.0 mL 10% Al（NO）3溶液，混匀，放置6 min，再加入10.0 mL 5% NaOH，用蒸馏水定容，摇匀，放置15 min。以相应的试剂为空白，在510 nm波长处测定吸光度，以标准芦丁浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制曲线。
1.2.3 正交试验。
通过预试验确定超声提取法条件，按照L9（34）设计4因素3水平的正交试验。称取阿育魏果样品1.0 g若干份，置于锥形瓶中，加入提取溶剂超声提取数分钟，过滤，取1.0 mL提取液进行显色反应，测定提取物中黄酮含量及提取率。选取时间（A）、功率（B）、料液比（C）、乙醇浓度（D）4个因素进行正交试验。超声波提取法因素及水平见表1。
1.2.4 数据处理。样品中的黄酮含量 （以芦丁计）=（C×V1×V3/W×V2）×100%，式中，C为样液含黄酮量（mg/mL）；V1为提取总体积（mL）；V2为显色时抽取体积（mL）；V3为显色时定容体积（mL）；W为称样重量（g）。
2 结果与分析
2.1 线性关系的考察 以标准芦丁浓度（8.00～48.00 μg/mL）为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得出线性方程（图1）：y=12.71x+0.002 7，R2=0.999 4，线性关系良好。
2.2 方法学考察
2.2.1 精密度考察。
量取对照溶液6份，每份1.0 mL，置于
25 mL量瓶中，按“1.2.2”顯色方法显色并测定吸光度，通过回归方程计算总黄酮含量。相对标准偏差为0.21%，表明精密度良好。
2.2.2 稳定性考察。
量取同一供试溶液6份，按“1.2.2”显色方法显色，在510 nm波长处每隔5 min测定吸光度1次，测定60 min。结果显示，供试溶液在30 min内的吸光度稳定，相对标准偏差为2.85%，而30 min后其吸光度下降明显，表明供试溶液在30 min内的稳定性良好。
2.2.3 重复性考察。
称取样品6份，按“1.2.2”显色方法显色并测定吸光度，计算其含量，相对标准偏差为2.77%，表明该方法重复性良好。
2.2.4 加样回收试验。
量取已知总黄酮含量的提取液6份，分别加入已知浓度的芦丁标准品溶液，按“1.2.2”项操作显色，在510 nm波长处测定吸光度，得出总黄酮含量，根据回收率公式计算出加样回收率。由表2可知，回收率在98.95%～107.09%，平均回收率为101.17%，相对标准偏差为2.92%。
2.3 正交试验结果
正交试验结果（表3）显示，乙醇浓度（D）对总黄酮提取效果的影响最大，料液比（C）和超声功率（B）影响依次减小，超声时间（A）的影响最小。最佳提取工艺组合为A2B2C3D1，即阿育魏果中总黄酮的最佳提取工艺
条件：超声时间为15 min，功率为150 W，料液比为1∶20，乙醇浓度为70%。
2.4 阿育魏果总黄酮提取率的测定 在“2.3”确定的最佳提取工艺条件下对阿育魏果进行超声提取，提取液按“1.2.2”进行总黄酮含量测定，平行试验3次。结果表明，总黄酮含量为10.078%，相对标准偏差为2.38%。
3 结论与讨论
目前，维吾尔药国家和地方标准体系已初步建立，基本保证了维吾尔医临床需求和质量，但仍有25.2%[7]的维吾尔药材没有质量标准，所以维吾尔药的质量标准亟需健全和完善。其中，总黄酮含量测定方法的考察一直是总黄酮研究的一个重要部分。该研究以药典为标准进行初步探讨，根据多次试验结果得出维吾尔药阿育魏果的最佳超声提取工艺：超声时间为15 min，功率为150 W，料液比为1∶20，乙醇浓度为70%。其操作方法简单常用，重复性、精密度、加样回收率均较好。超声提取法有助于节省提取溶剂并缩短提取时间。
此外，可通过石油醚脱脂脱色脱蜡、萃取等[8-9]工艺进一步提高提取含量，达到进一步优化的目的。
参考文献
[1] 中国医学百科全书编辑委员会.中国医学百科全书维吾尔医学[M].上海：上海科学技术出版社，2005：235.
[2] 新疆植物志编辑委员会.新疆植物志[M].乌鲁木齐：新疆科学技术出版社，2011：521-524.
[3] 中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准维吾尔药分册[M].乌鲁木齐：新疆科技卫生出版社，1999：42.
[4] 张慧，章立华，黄琼，等.维药阿育魏实总黄酮抗氧化活性研究[J].安徽农业科学，2014，42（15）：4624-4625，4639.
[5] 邬方宁.超声提取技术在现代中药中的应用[J].中草药，2007，38（2）：315-316.
[6] 国家药典委员会.中国药典：一部[M].北京：化学工业出版，2010：333.
[7] 苏来曼·哈力克，孙磊，吴光翠，等.维吾尔药质量标准现状分析及发展建议[J].中国药事，2015，29（12）：1256-1262.
[8] 陈建平，王金辉，王艳杰，等.蒙药瞿麦中总黄酮超声提取工艺研究及含量测定[J].中华中医药杂志，2013，28（9）：2580-2584.
[9] 曲中堂，王光利，项昭保，等.青果总黄酮的含量测定及超声提取工艺研究[J].食品工业科技，2012，33（7）：291-293.