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[摘要]目的：研究胎猪脱细胞主动脉（decellularized aorta of fetal pigs，DAFP）的生物相容性，确定其是否有作为支架材料用于小口径组织工程血管移植的潜力。方法：利用胰酶和核酸酶联合的脱细胞方法来制备胎猪主动脉脱细胞基质(DAFP)，将其作为小口径组织工程血管的生物支架材料移植在成年犬单侧颈总动脉处，并监测其移植处的血流通畅情况，后期又通过组织学染色观察组织工程血管的组织学结构；扫描电镜观察血管的内表面结构；透射电镜观察其内表面的内皮细胞再生情况。结果：组织学染色结果表明构建的小口径组织工程血管具有完整的内膜层及中膜层结构；扫描电镜结果显示组织工程血管内表面覆盖着完整的内皮细胞层。结论：DAFP有作为小直径组织工程血管支架用于体内移植的潜力。
[关键词]组织工程；血管移植；生物支架材料；细胞外基质
[中图分类号]R318 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2012）05-0773-03
The vivo study on decellularized aorta of fetal figs can be substituted for tissue engineered small-diameter blood vessel
ZHANG Ying-bo,LIU Guo-feng,LI Qing-chun,YANG Da-ping
(Department of Plastic Surgery,The Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University,Harbin 150086,Heilongjiang,China)
Abstract: Objective To study the biocompatibility of the DAFP,determining it weather have a potential as a scaffold of tissue engineered small-diameter blood vessel graft. Methods Carotid artery of fetal pig was removed cells by using Trypsin／EDTA,ribonuclease and desoxyribonuclease.Afterward， we transplanted the DAFP into unilateral carotid artery of 6 adult dogs individually.Both the DAFP and the tissue which have been transplanted were evaluated with Hematoxylin and Eosin (H&E) staining,scanning electron microscopy and transmission electron microscopy. Results H＆E staining and electron microscopy confirmed that carotid arteries have intact monolayer endothelial cells. Conclusion Decellularized aorta of fetal figs have the ability to substitute for further small-diameter vascular tissue engineering.
Key words:tissue engineering， vascular graft， biological scaffold， extracellular matrix
动脉粥样硬化及周围血管疾病是世界范围内危害人类健康的主要疾病， 并且发病率逐年上升[1]，病情严重的患者常需要通过小口径血管(内径<6mm)移植的手段进行外科手术治疗。自体静脉或者动脉（如：大隐静脉、内乳动脉等）是最好的替代物，但是约有30%的患者因缺少合适的自体血管，而必须采用组织工程血管来替代移植。在血管组织工程研究中，支架材料是组织工程构建血管的基本要素之一，包括高分子可生物降解聚合物材料和脱细胞生物材料[2]，在生物相容性和适宜的生物力学性质方面脱细胞生物材料明显优于高分子可生物降解聚合物材料，生物材料中经过脱细胞处理的异体血管基质很好地去除了抗原性， 移植后与受体细胞有较好的相容性[3-4]，因此也更适合用于小口径血管的高张力、低血流的特殊状态[5]，从而达到减少术后急性血栓、新内膜增生、动脉瘤形成、感染等病变发生的目的，有效地增加了移植血管的通畅率。本实验利用胰酶和核酸酶联合的脱细胞方法制备DAFP，将其作为小口径组织工程血管的生物支架材料，并在以往的实验中充分的验证这一组织工程血管支架材料的组织学特性及生物力学性质[6]。为了逐步向临床过渡提供可靠的依据，笔者进一步进行了动物模型的体内实验观察，将该脱细胞组织工程血管支架材料移植在成年犬单侧颈总动脉处并监测其存活状况，在确定组织工程血管内血流通畅；周围血肿基本吸收后，二次手术取出移入的组织工程血管，并进行组织学监测和电镜观察。
1 实验步骤
所有动物实验操作均在遵循实验动物保护及使用指南的指导下进行。
1.1组织的获取：实验所需的组织来源于当地较近的屠宰场，在无菌条件下取出新鲜的胎猪（顶臀长25～30cm的孕末期胚胎[7]）降主动脉，并置于冰冻生理盐水中运至实验室，这一转运方式保证了热缺血时间不超过30min。在清除脂肪和贴壁组织后，用无菌冷生理盐水对主动脉进行彻底冲洗，再将动脉组织经过下述的处理过程，准备成主动脉支架。
1.2主动脉支架的制备：利用胰蛋白酶和核酸酶连续消化方法制备DAFP，首先用0.1%胰蛋白酶+0.02%乙二胺四乙酸 (EDTA)溶液消化20h，每10h更新消化液;大量磷酸缓冲盐溶液(PBS)冲洗后，再用20μg/ml核糖核酸酶(RNase)+200μg/ml脱氧核糖核酸酶(DNase)溶液（溶液均来自：德国，勃林格，曼海姆）消化4h，大量PBS冲洗。以上消化过程均是在37℃、5%CO2、95% 空气及持续振荡条件下进行的。在处理前后取材检测，通过DNA定量分析和HE组织学染色评价细胞及细胞碎片的去除情况，使细胞DNA残留量少于0.1%。制备出长约22mm的脱细胞血管基质材料如图1、2，取部分支架材料分别置于10%中性甲醛溶液中和1%戊二醛溶液中，为后期的组织学染色和电镜观察做准备。
1.3 Ⅰ期手术：支架材料的受体为2岁半成年杂种家犬6只，雌雄不限，体重25～30kg。实验动物经常规麻醉后，取仰卧位四肢伸展并固定，颈部剔毛，常规消毒铺巾；依据组织工程血管的长度，于无菌条件下离断等长的犬单侧颈总动脉(如图3)，并用肝素反复冲洗断端；将血管支架在生理盐水浸泡约5min后，通过端端吻合术将血管支架移植入颈总动脉处(如图4)。术后3天进行抗生素治疗，防止术后感染和瘘管的形成。
1.4 术后观测：移植术后观测手术区域有无出血及血肿形成，动物有无发热、呼吸急促等生命体征的变化，并给予及时的处理。术后定期观察实验动物的生存状态，分别于术后10天、1个月，3个月及6个月的时期利用彩色多普勒进行血流通畅度的观测。
1.5 Ⅱ期手术：在确定移植入的血管支架已基本被宿主所接纳（无明显排斥反应）；血流通畅度良好；支架与正常血管的吻合处管壁内表面光滑后(约6个月后)，再次手术取出移植处的血管组织。术前准备同Ⅰ期手术；在原切口附近再次切开，剥离粘连组织，并切取移植入的支架血管和两端少许正常血管组织（颈总动脉处两个残留的断端直接进行结扎止血）；立即用肝素冲洗管腔，再将组织置于生理盐水中清洗；沿纵轴小心地将管腔剖开，再分别将组织置于10%中性甲醛和1%戊二醛溶液中4℃条件下保存，为下一步的组织学染色及电镜观察做准备。
1.6 组织学染色：将标本置于10%中性甲醛溶液中固定24h，常规石蜡包埋、切片，进行HE染色。在光学显微镜下对标本的结构进行组织学评价。
1.7 电镜观察：将标本在1%戊二醛溶液中固定24h，之后用1%锇酸作后固定2h;50%、70%、90%、100%丙酮梯度脱水，每级10min；50%、70%、90%、100%醋酸异戊酯置换， 每级10min;应用临界点干燥仪、液体CO2等进行干燥；干燥的标本固定在铝质标本台上，用溅射镀膜机镀金后，用扫描电镜系统观察并照相。透射电镜样本先用0.1%戊二醛和0.16mmol/L的二甲砷酸钠缓冲液预固定30min，而后2%戊二醛固定2h。经标准的锇化处理和包埋后，用透射电镜进行观察。
2 实验结果
2.1 大体观察：Ⅱ期手术取出的血管支架内表面光滑、管壁有弹性、与吻合口两端正常颈总动脉的管壁结构相似。
2.2 组织学观察：标本HE染色显示，图5A、C为脱细胞处理后的组织工程血管，如图清晰可见其细胞成分已被完全脱除，细胞外基质成分保存完整，血管内弹性膜连续完整。图5B、D为经过体内移植后的组织工程血管，官腔光滑，内表面形成一层连续完整的血管内皮细胞，细胞核深染(见图5D)，外层为纤维蛋白胶与平滑细胞的混合层，纤维蛋白胶在镜下表现为均质致密的结构，内部有少量的单个平滑肌细胞，同时可见纤维蛋白胶层与血管脱细胞基质结合紧密，没有明显的分离现象(见图5B)。
2.3 电镜观察：扫描电镜下可见移植后的组织工程血管的内表面已有内皮细胞覆盖，细胞之间结合紧密，内皮细胞间显露有脱细胞基质的纤维结构(图6B)。图6A，显示了未用于移植的组织工程血管内表面疏松的三维结构。图6C，为透射电镜下紧密连接的内皮细胞结构。
3 讨论
血管组织工程研究的支架材料主要分为两大类:生物支架材料和可降解高分子聚合物材料[8]。高分子聚合物材料可以在体内完全降解，理化性质可以人为控制，生产重复性好。但聚合物材料最大的不足之处是其生物相容性差，降解产物对细胞的生物学及新组织形成有多方面的不利影响[9]。生物支架材料主要由细胞外基质成分构成， 具有增加细胞黏附及新组织形成的生物学信号， 具有良好的体内外生物相容性[10]。血管组织工程支架材料的发展趋势将会是大量自然生物材料的应用，其中血管脱细胞基质材料具有理想的形态和生物相容性，逐渐成为血管组织工程研究的重要支架材料[11]。人源性生物材料的供应不足使人的同种异体血管脱细胞基质支架材料应用受到极大的限制，由于学者们发现，一定胎龄胚胎动物的某些组织具有较低的免疫原性，所以在当今人类异种器官移植领域研究中，猪的胚胎已成为人类器官组织移植研究的首选来源。本实验中采用的孕末期胎猪主动脉脱细胞基质(DAFP)材料具有极低的异种免疫原性、适当的生物力学性质以及良好的体内外生物相容性[6]，为进一步证明该材料的体内相容性，笔者将其成功地移植入家犬的颈总动脉处，并检测出支架血管的内表面有大量连续的内皮细胞覆盖。
综上所述，本实验为异种生物材料应用于人类小口径血管组织工程研究提供崭新的思路，也为DAFP材料的临床应用研究提供理论与实践依据。
[参考文献]
[1]McKee JA,Banik SS,Boyer MJ,et a1.Human arteries engineered in vitro[J].EMBO Rep,2003,4：633-638.
[2]Nerem RM,Seliktar D.Vascular tissue engineering[J].Annu Rev Biomed Eng,2001,3:225-243.
[3]Rieder E,Nigisch A,Dekan B,et al.Granulocyte-based immune response against decellularized or glutaraldehyde cross-linked vascular tissue[J].Biomaterials 2006,27(33):5634-5642.
[4]Martin ND,Schaner PJ,Tulenko TN,et al.In vivo behavior of decellularized veinallograft[J].Surg Res,2005,129(1):17-23.
[5]Vara DS,Salacinski HJ,Kannan RY,et al.Cardiovascular tissue engineering: state of the art[J].PatholBiol,2005,53(10):599-612.
[6]LIU Guo-feng,HE Zhi-juan,YANG Da-ping,et al.Decellularized aorta of fetal pigs as a potential scaffold for small diameter tissue engineered vascular graft[J].Chin Med J,2008,121(15):1398-1406.
[7]Salazar I,Sanchez Quinteiro P,Lombardero M,et al.The prenatal maturity of the accessory olfactory bulb in pigs[J].Chem Senses,2004,29:3-11.
[8]Nerem RM,Seliktar D.Vascular tissue engineering[J].Annu Rev Biomed Eng,2001,3:225-243.
[9]Stock U,Nagaashima M,Khalil PN,et al.Tissue engineered valve conduits in the pulmonary circulation[J].J Thoracic Cardiovasc Surg,2000,119:732-740.
[10]Stegemann JP,Kaszuba SN,Rowe SL.Review: advances in vascular tissue engineering using protein based biomaterials[J].Tissue Eng,2007,13(11):2601-2613.
[11]Schmidt CE,Baier JM.Acellular vascular tissues: natural biomaterials for tissue repair and tissue engineering[J].Biomaterials,2000,21(22):2215-2231.
[收稿日期]2011-11-17 [修回日期]2012-02-22
编辑/张惠娟
[关键词]组织工程；血管移植；生物支架材料；细胞外基质
[中图分类号]R318 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2012）05-0773-03
The vivo study on decellularized aorta of fetal figs can be substituted for tissue engineered small-diameter blood vessel
ZHANG Ying-bo,LIU Guo-feng,LI Qing-chun,YANG Da-ping
(Department of Plastic Surgery,The Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University,Harbin 150086,Heilongjiang,China)
Abstract: Objective To study the biocompatibility of the DAFP,determining it weather have a potential as a scaffold of tissue engineered small-diameter blood vessel graft. Methods Carotid artery of fetal pig was removed cells by using Trypsin／EDTA,ribonuclease and desoxyribonuclease.Afterward， we transplanted the DAFP into unilateral carotid artery of 6 adult dogs individually.Both the DAFP and the tissue which have been transplanted were evaluated with Hematoxylin and Eosin (H&E) staining,scanning electron microscopy and transmission electron microscopy. Results H＆E staining and electron microscopy confirmed that carotid arteries have intact monolayer endothelial cells. Conclusion Decellularized aorta of fetal figs have the ability to substitute for further small-diameter vascular tissue engineering.
Key words:tissue engineering， vascular graft， biological scaffold， extracellular matrix
动脉粥样硬化及周围血管疾病是世界范围内危害人类健康的主要疾病， 并且发病率逐年上升[1]，病情严重的患者常需要通过小口径血管(内径<6mm)移植的手段进行外科手术治疗。自体静脉或者动脉（如：大隐静脉、内乳动脉等）是最好的替代物，但是约有30%的患者因缺少合适的自体血管，而必须采用组织工程血管来替代移植。在血管组织工程研究中，支架材料是组织工程构建血管的基本要素之一，包括高分子可生物降解聚合物材料和脱细胞生物材料[2]，在生物相容性和适宜的生物力学性质方面脱细胞生物材料明显优于高分子可生物降解聚合物材料，生物材料中经过脱细胞处理的异体血管基质很好地去除了抗原性， 移植后与受体细胞有较好的相容性[3-4]，因此也更适合用于小口径血管的高张力、低血流的特殊状态[5]，从而达到减少术后急性血栓、新内膜增生、动脉瘤形成、感染等病变发生的目的，有效地增加了移植血管的通畅率。本实验利用胰酶和核酸酶联合的脱细胞方法制备DAFP，将其作为小口径组织工程血管的生物支架材料，并在以往的实验中充分的验证这一组织工程血管支架材料的组织学特性及生物力学性质[6]。为了逐步向临床过渡提供可靠的依据，笔者进一步进行了动物模型的体内实验观察，将该脱细胞组织工程血管支架材料移植在成年犬单侧颈总动脉处并监测其存活状况，在确定组织工程血管内血流通畅；周围血肿基本吸收后，二次手术取出移入的组织工程血管，并进行组织学监测和电镜观察。
1 实验步骤
所有动物实验操作均在遵循实验动物保护及使用指南的指导下进行。
1.1组织的获取：实验所需的组织来源于当地较近的屠宰场，在无菌条件下取出新鲜的胎猪（顶臀长25～30cm的孕末期胚胎[7]）降主动脉，并置于冰冻生理盐水中运至实验室，这一转运方式保证了热缺血时间不超过30min。在清除脂肪和贴壁组织后，用无菌冷生理盐水对主动脉进行彻底冲洗，再将动脉组织经过下述的处理过程，准备成主动脉支架。
1.2主动脉支架的制备：利用胰蛋白酶和核酸酶连续消化方法制备DAFP，首先用0.1%胰蛋白酶+0.02%乙二胺四乙酸 (EDTA)溶液消化20h，每10h更新消化液;大量磷酸缓冲盐溶液(PBS)冲洗后，再用20μg/ml核糖核酸酶(RNase)+200μg/ml脱氧核糖核酸酶(DNase)溶液（溶液均来自：德国，勃林格，曼海姆）消化4h，大量PBS冲洗。以上消化过程均是在37℃、5%CO2、95% 空气及持续振荡条件下进行的。在处理前后取材检测，通过DNA定量分析和HE组织学染色评价细胞及细胞碎片的去除情况，使细胞DNA残留量少于0.1%。制备出长约22mm的脱细胞血管基质材料如图1、2，取部分支架材料分别置于10%中性甲醛溶液中和1%戊二醛溶液中，为后期的组织学染色和电镜观察做准备。
1.3 Ⅰ期手术：支架材料的受体为2岁半成年杂种家犬6只，雌雄不限，体重25～30kg。实验动物经常规麻醉后，取仰卧位四肢伸展并固定，颈部剔毛，常规消毒铺巾；依据组织工程血管的长度，于无菌条件下离断等长的犬单侧颈总动脉(如图3)，并用肝素反复冲洗断端；将血管支架在生理盐水浸泡约5min后，通过端端吻合术将血管支架移植入颈总动脉处(如图4)。术后3天进行抗生素治疗，防止术后感染和瘘管的形成。
1.4 术后观测：移植术后观测手术区域有无出血及血肿形成，动物有无发热、呼吸急促等生命体征的变化，并给予及时的处理。术后定期观察实验动物的生存状态，分别于术后10天、1个月，3个月及6个月的时期利用彩色多普勒进行血流通畅度的观测。
1.5 Ⅱ期手术：在确定移植入的血管支架已基本被宿主所接纳（无明显排斥反应）；血流通畅度良好；支架与正常血管的吻合处管壁内表面光滑后(约6个月后)，再次手术取出移植处的血管组织。术前准备同Ⅰ期手术；在原切口附近再次切开，剥离粘连组织，并切取移植入的支架血管和两端少许正常血管组织（颈总动脉处两个残留的断端直接进行结扎止血）；立即用肝素冲洗管腔，再将组织置于生理盐水中清洗；沿纵轴小心地将管腔剖开，再分别将组织置于10%中性甲醛和1%戊二醛溶液中4℃条件下保存，为下一步的组织学染色及电镜观察做准备。
1.6 组织学染色：将标本置于10%中性甲醛溶液中固定24h，常规石蜡包埋、切片，进行HE染色。在光学显微镜下对标本的结构进行组织学评价。
1.7 电镜观察：将标本在1%戊二醛溶液中固定24h，之后用1%锇酸作后固定2h;50%、70%、90%、100%丙酮梯度脱水，每级10min；50%、70%、90%、100%醋酸异戊酯置换， 每级10min;应用临界点干燥仪、液体CO2等进行干燥；干燥的标本固定在铝质标本台上，用溅射镀膜机镀金后，用扫描电镜系统观察并照相。透射电镜样本先用0.1%戊二醛和0.16mmol/L的二甲砷酸钠缓冲液预固定30min，而后2%戊二醛固定2h。经标准的锇化处理和包埋后，用透射电镜进行观察。
2 实验结果
2.1 大体观察：Ⅱ期手术取出的血管支架内表面光滑、管壁有弹性、与吻合口两端正常颈总动脉的管壁结构相似。
2.2 组织学观察：标本HE染色显示，图5A、C为脱细胞处理后的组织工程血管，如图清晰可见其细胞成分已被完全脱除，细胞外基质成分保存完整，血管内弹性膜连续完整。图5B、D为经过体内移植后的组织工程血管，官腔光滑，内表面形成一层连续完整的血管内皮细胞，细胞核深染(见图5D)，外层为纤维蛋白胶与平滑细胞的混合层，纤维蛋白胶在镜下表现为均质致密的结构，内部有少量的单个平滑肌细胞，同时可见纤维蛋白胶层与血管脱细胞基质结合紧密，没有明显的分离现象(见图5B)。
2.3 电镜观察：扫描电镜下可见移植后的组织工程血管的内表面已有内皮细胞覆盖，细胞之间结合紧密，内皮细胞间显露有脱细胞基质的纤维结构(图6B)。图6A，显示了未用于移植的组织工程血管内表面疏松的三维结构。图6C，为透射电镜下紧密连接的内皮细胞结构。
3 讨论
血管组织工程研究的支架材料主要分为两大类:生物支架材料和可降解高分子聚合物材料[8]。高分子聚合物材料可以在体内完全降解，理化性质可以人为控制，生产重复性好。但聚合物材料最大的不足之处是其生物相容性差，降解产物对细胞的生物学及新组织形成有多方面的不利影响[9]。生物支架材料主要由细胞外基质成分构成， 具有增加细胞黏附及新组织形成的生物学信号， 具有良好的体内外生物相容性[10]。血管组织工程支架材料的发展趋势将会是大量自然生物材料的应用，其中血管脱细胞基质材料具有理想的形态和生物相容性，逐渐成为血管组织工程研究的重要支架材料[11]。人源性生物材料的供应不足使人的同种异体血管脱细胞基质支架材料应用受到极大的限制，由于学者们发现，一定胎龄胚胎动物的某些组织具有较低的免疫原性，所以在当今人类异种器官移植领域研究中，猪的胚胎已成为人类器官组织移植研究的首选来源。本实验中采用的孕末期胎猪主动脉脱细胞基质(DAFP)材料具有极低的异种免疫原性、适当的生物力学性质以及良好的体内外生物相容性[6]，为进一步证明该材料的体内相容性，笔者将其成功地移植入家犬的颈总动脉处，并检测出支架血管的内表面有大量连续的内皮细胞覆盖。
综上所述，本实验为异种生物材料应用于人类小口径血管组织工程研究提供崭新的思路，也为DAFP材料的临床应用研究提供理论与实践依据。
[参考文献]
[1]McKee JA,Banik SS,Boyer MJ,et a1.Human arteries engineered in vitro[J].EMBO Rep,2003,4：633-638.
[2]Nerem RM,Seliktar D.Vascular tissue engineering[J].Annu Rev Biomed Eng,2001,3:225-243.
[3]Rieder E,Nigisch A,Dekan B,et al.Granulocyte-based immune response against decellularized or glutaraldehyde cross-linked vascular tissue[J].Biomaterials 2006,27(33):5634-5642.
[4]Martin ND,Schaner PJ,Tulenko TN,et al.In vivo behavior of decellularized veinallograft[J].Surg Res,2005,129(1):17-23.
[5]Vara DS,Salacinski HJ,Kannan RY,et al.Cardiovascular tissue engineering: state of the art[J].PatholBiol,2005,53(10):599-612.
[6]LIU Guo-feng,HE Zhi-juan,YANG Da-ping,et al.Decellularized aorta of fetal pigs as a potential scaffold for small diameter tissue engineered vascular graft[J].Chin Med J,2008,121(15):1398-1406.
[7]Salazar I,Sanchez Quinteiro P,Lombardero M,et al.The prenatal maturity of the accessory olfactory bulb in pigs[J].Chem Senses,2004,29:3-11.
[8]Nerem RM,Seliktar D.Vascular tissue engineering[J].Annu Rev Biomed Eng,2001,3:225-243.
[9]Stock U,Nagaashima M,Khalil PN,et al.Tissue engineered valve conduits in the pulmonary circulation[J].J Thoracic Cardiovasc Surg,2000,119:732-740.
[10]Stegemann JP,Kaszuba SN,Rowe SL.Review: advances in vascular tissue engineering using protein based biomaterials[J].Tissue Eng,2007,13(11):2601-2613.
[11]Schmidt CE,Baier JM.Acellular vascular tissues: natural biomaterials for tissue repair and tissue engineering[J].Biomaterials,2000,21(22):2215-2231.
[收稿日期]2011-11-17 [修回日期]2012-02-22
编辑/张惠娟