论文部分内容阅读
摘 要：氨基甲酸乙酯广泛存在于发酵食品中，2007年被世界卫生组织癌症研究机构列为2A类致癌物。国内外研究者开发出了适用于不同样品条件和研究目的检测方法。分类介绍了近年来国内外文献报道的传统和快速检测氨基甲酸乙酯方法，包括色谱法、光谱法以及其他检测方法，对这些方法在发酵食品中的应用特点和检测效果进行综述，并对我国未来氨基甲酸乙酯检测技术的发展趋势进行展望。
关键词：氨基甲酸乙酯;发酵食品;传统检测;快速检测
氨基甲酸乙酯（EC）在工业、畜牧业和医学领域应用广泛[1-4]，而在食品领域，EC则是发酵食品在生产和储存过程中不可避免产生的副产物，常见于黄酒、酱油和腐乳等食品中[5]。不同发酵食品中EC的形成机理不同，但大多与酒精和微生物代谢相关[6]。EC的主要前体物质有尿素、瓜氨酸、氨甲酰磷酸、氢氰酸以及焦碳酸二乙酯等，这些前体物质在微生物的作用下与乙醇反应产生EC[7-10]。动物毒性实验表明，EC是一种多点位致癌物，短期、大剂量注射可诱发啮齿类动物出现肺癌、皮肤癌等肿瘤[11-12]。给非人类灵长类动物长期每日口服EC，可诱发其出现肺腺癌和血管瘤等[13]。EC在CYP450的作用下分别转化为N-羟基氨基甲酸乙酯和乙烯基氨基甲酸乙酯，這两种物质能引起DNA、RNA结构损伤，并使机体中蛋白质发生加聚反应，进而引发癌症[14-15]。因为EC在人体中的代谢机理与其在啮齿类动物中的原理十分相似，所以对于人类而言，EC是一种潜在的致癌物质，2007年，世界卫生组织国际癌症研究机构将EC由2B类提高为2A类致癌物[16]。因此，对发酵食品中的EC进行定性和定量分析检测具有重大意义，本文将对发酵食品中EC的标准与各种检测方法进行介绍与评价，并对其未来发展进行展望。
1 国内外酒饮料中氨基甲酸乙酯的标准
早在1985年，加拿大卫生管理部门就根据不同酒饮料中EC含量差异，对多种酒饮料中的EC制定了不同等级的强制限量：葡萄酒≤30 μg/L、强化酒≤100 μg/L、蒸馏酒≤150 μg/L、清酒≤200 μg/L、白兰地≤400 μg/L[17];1989年，美国食品药品管理局对酒类中的EC制定了推荐限量标准：葡萄酒≤15 μg/L、强化酒≤60 μg/L[18];法国的限量标准为蒸馏酒≤150 μg/L、白兰地≤1 000 μg/L;捷克的限量标准与加拿大基本一致;韩国、德国和瑞士等国家也对个别酒类制定了限量标准;2002年，联合国粮食及农业组织规定酒饮料中的EC限量为20 μg/L[19] （表1）。
目前，我国出台的相关标准（现行有效）有三部，分别为《GB 5009.223—2014 食品安全国家标准 食品中氨基甲酸乙酯的测定》《SN/T 0285—2012 出口酒中氨基甲酸乙酯残留量检测方法 气相色谱—质谱法》《GB/T 34266—2017 黄酒中氨基甲酸乙酯预防控制技术措施指南》[18-20]。虽然我国对食品中EC的检测和防控较为关注，但是没有相应的限量标准。研究表明，我国发酵食品中EC含量最高的前三名分别是黄酒、腐乳和酱油，平均浓度分别为307.2 、123 、108 μg/L，其次是料酒87 μg/L、白酒72 μg/L、食醋51 μg/L[21-24]，这对于我国发酵食品产业和国民健康都具有一定的不良影响。
2 氨基甲酸乙酯检测方法
为了满足不同发酵食品基质中的EC检测，研究者已经开发出了多种定性和定量的EC检测方法以满足不同需求（表2）。传统的检测方法为色谱法，基于大型分析仪器，能够对食品中的EC进行准确且灵敏的检测[25];随着食品检测技术的发展和实际生产生活的需要，研究者也开发出了更加便捷和快速的检测方法[26]，如酶法、免疫分析法和分子印迹法等。
2.1 色谱法
EC色谱法检测技术大多是基于液相色谱和气相色谱按照不同的检测需求与不同检测器联用，对EC痕量检测，采取净化/浓缩预处理程序，以确保方法灵敏度高、重复性好、适用性广，能够满足不同基质中EC定量分析[26]。
2.1.1 液相色谱 Alberts等[27]运用反相固相萃取，建立了液相色谱-大气压化学离子化-串联质谱的EC检测方法，检出限为0.25 μg/L，分别对葡萄酒和烈性酒中的EC进行定量分析，平均回收率为94.5%。该法虽然灵敏度和可重复性高，但是较为耗费时间和经济成本。Leca等[28]以液-液微萃取法用少量乙酸乙酯提取强化葡萄酒中的EC，运用反相液相色谱-电喷雾串联质谱，以EC的二次离子跃迁对EC进行定量，检出限和定量限分别为0.17 、0.52 μg/L，回收率为93%～114%，且重现性较好。该方法有效减少了样品前处理时有机溶剂的使用量，同时具有较好的灵敏度。Ojeda等[29]运用液相色谱-荧光法检测EC，使用高氯酸酸化样品，用9-呫吨醇对EC进行自动柱前衍生使其具有荧光性质，用荧光检测器进行捕获，进而计算出EC含量，该法检出限为0.52 μg/L，应用于葡萄酒中EC的检测，回收率为101%～103%。这种通过衍生化进行样品前处理的方法，极大地缩短了前处理时间，使样品检测前处理过程更加快速简便。
2.1.2 气相色谱 GC-MS结合了化合物的分离和鉴定，并具有高分辨率和重现性的特点。Ma等[30]建立了一种基于乙醇和K2HPO4水溶液两相系统的气相色谱-质谱联用方法，用于定量红酒中EC，研究者优化了萃取时间、温度、pH和乙醇浓度，该方法的线性工作范围是10～100 μg/L，检出限和定量限分别为2.8、9.2 μg/L。Xian等[31]建立了一种基于冰浴辅助氢氧化钠纯化的GC-MS/MS法，检测啤酒和黄酒中的EC，样品在加入内标后用乙腈-乙酸乙酯萃取，在冰浴条件下用NaOH纯化浓缩后上机检测，该法线性范围为2～200 μg/ L，检出限为0.1～0.5 μg/ kg，定量限为0.5～1.5 μg/ kg，回收率为81.5%～121.0%。赵依芃等[32]建立了稳定同位素稀释-气相色谱-串联质谱法检测乳酪、腐乳和酸奶等食品中的EC，在前处理时向样品中加入EC-d5作为内标物，该方法的检出限不超过5 ng/g，回收率在94.2%～108.3%之间。GC-MS法的灵敏度好、稳定性和回收率高，但是检测结果会受到萃取条件如溶剂、温度和时间的影响，同时样品基质和酒精含量对检测结果也有一定的影响，对低EC含量的食品检测差异性比较大。 2.1.3 薄层色谱法 黄秋婷等[33]建立了薄层色谱数码成像法，将EC直接上样至薄层板，用在磷酸创造的酸性环境下用肉桂醛对EC进行衍生，得到的衍生物能够在365 nm的激发波长下产生445～460 nm范围内的荧光，展开剂展开后在暗箱式紫外分析仪在365 nm下扫描薄层板，运用MATLAB对衍生物的荧光斑点进行积分定量，该方法的检出限为59.5 μg/L，样品加标回收率为60.12%～84.70%。该法操作方便简单，无需前处理，但由于人工上样不均匀且不同薄层板之间的差异较大，因此该法的稳定性较差。
2.2 光谱法
虽然色谱技术能够准确对痕量的EC进行定量检测，但是由于其操作复杂、成本较高，无法实现大规模快速筛查，因此，光谱技术可以作为色谱技术的补充，对EC进行半定量的筛查。常用的EC光谱检测技术主要有傅里叶变换红外光谱、核磁共振波谱和表面增强拉曼光谱等。
2.2.1 傅里叶变换红外光谱 随着化学计量学以及计算机技术的发展，研究人员将傅里叶变换红外光谱法运用在食品检测领域[34]。Manley等[35]运用软件独立建模分类法结合FTIR，对葡萄汁和葡萄酒中EC含量进行了大批量检测，虽然样品分辨率达到了80%～88%，但是样品EC实际值和检测值之间的相关性较差（r=0.47）。Lache Nmeier等[36]用傅立葉变换红外光谱仪，通过偏最小二乘回归衰减法对82个果酒样品中的EC含量进行监测，同时对比GC-MS/MS检测结果，发现FTIR检测方法定量分析的准确性较差，但由于前处理简单、检测快速方便，该方法可以作为半定量分析用于大规模筛查。
2.2.2 核磁共振波谱 Monakhova等[37]首次将核磁共振波谱技术于偏最小二乘法（PLS）结合，对112个果酒样品进行检测，核磁共振波谱提供全面的结构信息，研究者基于芳香族区域中的PLS校准进行间接定量，通过GC-MS/MS验证PLS模型的准确性，结果发现，在EC含量小于1 mg/L时，该方法能够提供可靠的EC定量分析，具有良好的灵敏度和选择性。
2.2.3 表面增强拉曼光谱 表面增强拉曼光谱法是通过检测样品吸附在金、银等粗糙表面的拉曼散射信号，从而获得待测样品信息的方法[38]。Yang等[39]以银包裹的纳米金粒子制备银星纳米颗粒作为信号放大器，可在样品中提高EC的拉曼增强作用，选取1 003 cm-1处的特征谱带用于EC定量，检出限范围为0.8～11.9 μg/L。Qi等[40]用AgNO3、抗坏血酸和聚乙烯吡咯烷酮制备了花形银纳米颗粒，将其吸移在硅片上，以785 nm为激发波长，选取857 cm-1处的特征谱带建立拉曼强度和EC浓度之间的回归模型，该方法的线性范围为10-9～10-5 mol/L，在白酒样品的检测中，回收率为89.94%～90.14%。Du等[41]将EC吸附在Ag20团簇上，形成络合物C3H7NO2-Ag20，该络合物的拉曼强度比EC常规拉曼强度增强了10倍左右，在化学与电磁场增强共同作用下，络合物的表面拉曼增强因子达到3.6×1010，因此可以看出表面增强拉曼光谱法能够对EC进行痕量检测。
2.3 其他方法
随着快检技术的发展，越来越多国内外研究者致力于EC快检方法的研究和建立，如酶法、免疫分析法以及分子印迹法等快检方法。
2.3.1 酶法 酶分析法是利用酶的特异性这一特点，对待测物进行定性和定量分析。刘丽斌等[42]发现，EC在溴水-氢氧化钠增敏处理后，对乙酰胆碱酯酶活性的抑制效果显著提高，并且在一定范围内，酶活性的抑制效果与EC的浓度线性相关，该检测方法在1～7.5 mg/L范围内线性良好，检出限为41.77 μg/L。该方法操作简单，条件温和，检测成本较低。LU等[43]建立谷氨酸脱氢酶/氨基甲酸酯降解酶的双酶偶联反应体系，根据监测NADH的浓度变化来实现对EC的定量检测，进而开发了基于双酶体系的分光光度法检测EC，在NADH在340 nm处的吸光度与EC的浓度在0.3～50 μmol/L范围内线性正相关，该法检出限为9.28 nmol/L。Zhang等[44]同样基于谷氨酸脱氢酶/氨基甲酸酯降解酶的双酶体系，将两种酶用壳聚糖和明胶包裹并固定在石墨电极表面，从而建立电流型生物传感器，该传感器的检测范围为0.4～50 μmol/L，检出限为5.30 nmol/L，测定黄酒中的EC，回收率为100%～103%。这种酶分析法是基于酶的高度专一性对EC进行定量，无需对样品前处理，易于操作，检测结果较为稳定，灵敏度较高。
2.3.2 免疫分析法 免疫分析法是基于抗原和抗体的特异性识别和可逆性结合而建立的相对高效的检测方法。马晓驰等[45]设计并合成了一种新型EC半抗原，进而制备抗原及抗血清，抗血清效价1∶10 000，对抗血清的免疫活性进行评价，灵敏度和特异性显示良好。Luo等[46]将EC用9-呫吨醇衍生化后，制备其抗原和抗体，并通过间接ELISA法检测黄酒中的EC，检出限为166 μg/L，回收率为84.4%～100.9%。在上述研究的基础上，Luo等[47]将荧光纳米硅颗粒引入ELISA的OPD-H2O2底物显色系统中，建立荧光-酶联免疫吸附法，用于检测红酒中的EC，辣根过氧化物酶催化OPD的产物DAP可以有效地猝灭纳米硅在440 nm处的发射的荧光信号，大大提升了ELISA的灵敏度，该方法的工作范围为3.9～105 μg/L，检出限为2.6 μg/ L。任勃儒[48]制备EC的抗体和抗原，用胶体金标记EC抗体，与EC人工抗原发生特异性结合，以此制备金标免疫层析试纸条用于检测发酵醋，该方法的检出限为0.5 μg/L，选择性高，无前处理过程，检测过程方便快捷、操作人员学习成本低。
2.3.3 分子印迹法 分子印迹聚合物是以待测分子为模板，通过分子印迹技术合成的物质，该聚合物具有特异性识别位点，能够对模板分子进行高效的特异性识别和选择性吸附。刘纪红等[49]以EC作为模板分子、MMA为功能单体制备了EC分子印迹聚合物，再与CdSe/CdS核壳量子点结合，制备了EC荧光分子印记复合微球，使其具有较好的荧光猝灭作用，利用该微球检测EC，检测线性范围为1 ～5 mmol/L。李曼丽[50]以EC为模板分子，PTMSO为功能单体制备了EC分子印迹聚合物，并建立了EC分子印迹电化学传感器，该方法线性范围为10-10～10-6 mol/L，检出限为3.14 nmol/L，回收率为97.2%～108%。Wu等[51]首次将SERS、固相萃取SPE与分子印迹技术结合用于检测黄酒中的EC，结果表明，该法在0～500 mg/L 范围内对黄酒中EC的含量有较好的定量能力。分子印迹法特异性强，可以排除样品基质对检测结果的影响，同时可以结合不同的检测手段，以提高检测灵敏度。 3 结论与展望
近年来，国内外研究者开发了许多EC的检测方法，各种方法在灵敏度、回收率、稳定性和便捷性上各有特色，互为补充。对于痕量检测而言，色谱法尤其是气相色譜-质谱法应用广泛，其准确性、灵敏度和检测的稳定性相较于其他方法较高，但是由于前处理过程复杂、检测成本较高，该方法无法满足大规模的现场筛查工作。因此，国内外研究者开发出了诸多其他可用于大规模筛查的快速检测方法，操作简单、便携度高，且对EC具有较好的选择性，能够达到对EC的定性和半定量检测。
发酵食品在我国日常生活中随处可见且种类繁多，国民对其质量安全也十分重视。因此，针对传统仪器检测法，应开发更加高通量、便捷快速的前处理方法，以提高检测效率;针对快检方法，排除基质效应的影响、优化现有方法并建立能够检测不同食品基质中EC的方法具有重要意义;同时，我国应当尽快出台EC在发酵食品中的限量标准，以此来促进我国发酵食品产业的健康和稳定发展。
参考文献
[1]Schmidt C F，Harer W B.The action of drugs on respiration：II.ether，chloroform，chloral，urethane，luminal，magnesium，caffeine，strychnine，and atropine[J]. Journal of Experimental Medicine，1922，37（1）：69-81.
[2]Hawkins J A，Murphy J B.The effect of ethyl urethane anesthesia on the acid-base equilibrium and cell contents of the blood[J]. Journal of Experimental Medicine，1925，42（5）：609-618.
[3]Ough C S.Ethyl carbamate in fermented beverages and foods.I.Naturally occurring ethyl carbamate[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，1976，24（2）：323-328.
[4]Canas B J，et al.Ethyl carbamate levels in selected fermented foods and beverages[J]. Journal - Association of Official Analytical Chemists，1989，72（6）：873-876.
[5]Lee K G，et al.Effect of citrulline，urea，ethanol，and urease on the formation ofn，ethyl carbamate in soybean paste model system[J]. Food Chemistry，2015，189（15）：74-79.
[6]Ough C S.Ethyl carbamate in fermented beverages and foods.II.Possible formation of ethylcarbamate from diethyl dicarbonate addition to wine[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，1976，24（2）：328-331.
[7]Haque M R，Bradbury J H.Total cyanide determination of plants and foods using the picrate and acid hydrolysis methods[J]. Food Chemistry，2002，77（1）：107-114.
[8]Zhou K，Siroli L，Patrignani F，et al.Formation of ethyl carbamate during the production process of cantonese soy sauce[J]. Molecules，2019，24（8）：1474.
[9]Anderson N，Pual S H，Henry L M.Induction of pulmonary tumors in mice with ethyl carbamate （urethane）[J]. Journal of the National Cancer Institute，1943，4 （3）：309-319.
[10]Beland F A，et al.Effect of ethanol on the tumorigenicity of urethane （ethyl carbamate）in B6C3F1 mice[J]. Food and Chemical Toxicology，2005，43（1）：19.
[11]Schlatter J，Lutz W K.The carcinogenic potential of ethyl carbamate （urethane）：risk assessment at human dietary exposure levels[J]. Food and Chemical Toxicology，1990，28（3）：205-211.
[12]Philipp H，et al.Genotoxicity of ethyl carbamate （urethane）in Salmonella，yeast and human lymphoblastoid cells[J]. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis，1997，390（1-2）：11-19. [44]Zhang Z W，Lu X X，Tian Y P，et al.High-sensitive electrochemical determination of ethyl carbamate using urethanase and glutamate dehydrogenase modified electrode[J]. Electroanalysis，2017，29（2）：481-488.
[45]马晓驰，孙玉凤，陈卫华.新型氨基甲酸乙酯人工抗原的制备与表征[J]. 食品安全质量检测学报，2020，2（11）：556-561.
[46]Luo L，et al.Development of an indirect ELISA for the determination of ethyl carbamate in Chinese rice wine[J]. Analytica Chimica Acta，2016（950）：162-169.
[47]Luo L，Song Y，Zhu C Z，et al.Fluorescent silicon nanoparticles-based ratiometric fluorescence immunoassay for sensitive detection of ethyl carbamate in red wine[J]. Sensors and Actuators B-Chemical，2018（255）：2742-2749.
[48]任勃儒.发酵醋液中氨基甲酸乙酯免疫快速检测技术研究[D].河北保定：河北大学，2016.
[49]刘纪红，杨卫海，严守雷，等.氨基甲酸乙酯荧光分子印迹微球识别机理及其荧光特性研究[J]. 食品科学，2010，31（Z1）：14-18.
[50]李曼丽.氨基甲酸乙酯的分析方法的研究[D].江苏无锡：江南大学，2016：27-36.
[51]Wu Z Z，et al.Highly sensitive determination of ethyl carbamate in alcoholic beverages by surface-enhanced Raman spectroscopy combined with a molecular imprinting polymer[J]. RSC Advances，2016，6（111）：109442-109452.
Research Advancements on Detection Methods of Ethyl Carbamate in Fermented Food
MA Xiao-chi，JIN Nuo，LIU Jia-meng，SUN Jing，JIA Ning，SUN Yu-feng*，FAN Bei*
（Institute of Food Science and Technology，Chinese Academy of Agricultural Sciences/ Key Laboratory of Agro-products Quality and Safety in Harvest，Storage，Transportation，Management and Control，MOA，Beijing 100193，China）
Abstract：Ethyl carbamate is widely found in fermented foods.In 2007，ethyl carbamate was classified as a Class 2A carcinogen by the International Agency for Research on Cancer of the World Health Organization.Researchers have developed detection methods suitable for different sample conditions and research purposes.This article reviewed the traditional and rapid methods for the detection of ethyl carbamate，including chromatography，spectroscopy，and other detection methods，and describes the application characteristics and detection results of these methods in fermented food.The development trend of ethyl ester detection technology is prospected.
Keywords：ethyl carbamate;fermented food;traditional detection;rapid detection
基金項目：国家农产品产地收贮运质量安全风险评估项目（项目编号：GJFP2019019）。
作者简介：马晓驰（1995— ），女，硕士研究生，研究方向：食品质量与安全。
共同通信作者：孙玉凤（1984— ），女，博士，副研究员，研究方向：农产品质量安全与品质评价;范蓓（1981— ），女，博士，研究员，研究方向：农产品质量与安全。
关键词：氨基甲酸乙酯;发酵食品;传统检测;快速检测
氨基甲酸乙酯（EC）在工业、畜牧业和医学领域应用广泛[1-4]，而在食品领域，EC则是发酵食品在生产和储存过程中不可避免产生的副产物，常见于黄酒、酱油和腐乳等食品中[5]。不同发酵食品中EC的形成机理不同，但大多与酒精和微生物代谢相关[6]。EC的主要前体物质有尿素、瓜氨酸、氨甲酰磷酸、氢氰酸以及焦碳酸二乙酯等，这些前体物质在微生物的作用下与乙醇反应产生EC[7-10]。动物毒性实验表明，EC是一种多点位致癌物，短期、大剂量注射可诱发啮齿类动物出现肺癌、皮肤癌等肿瘤[11-12]。给非人类灵长类动物长期每日口服EC，可诱发其出现肺腺癌和血管瘤等[13]。EC在CYP450的作用下分别转化为N-羟基氨基甲酸乙酯和乙烯基氨基甲酸乙酯，這两种物质能引起DNA、RNA结构损伤，并使机体中蛋白质发生加聚反应，进而引发癌症[14-15]。因为EC在人体中的代谢机理与其在啮齿类动物中的原理十分相似，所以对于人类而言，EC是一种潜在的致癌物质，2007年，世界卫生组织国际癌症研究机构将EC由2B类提高为2A类致癌物[16]。因此，对发酵食品中的EC进行定性和定量分析检测具有重大意义，本文将对发酵食品中EC的标准与各种检测方法进行介绍与评价，并对其未来发展进行展望。
1 国内外酒饮料中氨基甲酸乙酯的标准
早在1985年，加拿大卫生管理部门就根据不同酒饮料中EC含量差异，对多种酒饮料中的EC制定了不同等级的强制限量：葡萄酒≤30 μg/L、强化酒≤100 μg/L、蒸馏酒≤150 μg/L、清酒≤200 μg/L、白兰地≤400 μg/L[17];1989年，美国食品药品管理局对酒类中的EC制定了推荐限量标准：葡萄酒≤15 μg/L、强化酒≤60 μg/L[18];法国的限量标准为蒸馏酒≤150 μg/L、白兰地≤1 000 μg/L;捷克的限量标准与加拿大基本一致;韩国、德国和瑞士等国家也对个别酒类制定了限量标准;2002年，联合国粮食及农业组织规定酒饮料中的EC限量为20 μg/L[19] （表1）。
目前，我国出台的相关标准（现行有效）有三部，分别为《GB 5009.223—2014 食品安全国家标准 食品中氨基甲酸乙酯的测定》《SN/T 0285—2012 出口酒中氨基甲酸乙酯残留量检测方法 气相色谱—质谱法》《GB/T 34266—2017 黄酒中氨基甲酸乙酯预防控制技术措施指南》[18-20]。虽然我国对食品中EC的检测和防控较为关注，但是没有相应的限量标准。研究表明，我国发酵食品中EC含量最高的前三名分别是黄酒、腐乳和酱油，平均浓度分别为307.2 、123 、108 μg/L，其次是料酒87 μg/L、白酒72 μg/L、食醋51 μg/L[21-24]，这对于我国发酵食品产业和国民健康都具有一定的不良影响。
2 氨基甲酸乙酯检测方法
为了满足不同发酵食品基质中的EC检测，研究者已经开发出了多种定性和定量的EC检测方法以满足不同需求（表2）。传统的检测方法为色谱法，基于大型分析仪器，能够对食品中的EC进行准确且灵敏的检测[25];随着食品检测技术的发展和实际生产生活的需要，研究者也开发出了更加便捷和快速的检测方法[26]，如酶法、免疫分析法和分子印迹法等。
2.1 色谱法
EC色谱法检测技术大多是基于液相色谱和气相色谱按照不同的检测需求与不同检测器联用，对EC痕量检测，采取净化/浓缩预处理程序，以确保方法灵敏度高、重复性好、适用性广，能够满足不同基质中EC定量分析[26]。
2.1.1 液相色谱 Alberts等[27]运用反相固相萃取，建立了液相色谱-大气压化学离子化-串联质谱的EC检测方法，检出限为0.25 μg/L，分别对葡萄酒和烈性酒中的EC进行定量分析，平均回收率为94.5%。该法虽然灵敏度和可重复性高，但是较为耗费时间和经济成本。Leca等[28]以液-液微萃取法用少量乙酸乙酯提取强化葡萄酒中的EC，运用反相液相色谱-电喷雾串联质谱，以EC的二次离子跃迁对EC进行定量，检出限和定量限分别为0.17 、0.52 μg/L，回收率为93%～114%，且重现性较好。该方法有效减少了样品前处理时有机溶剂的使用量，同时具有较好的灵敏度。Ojeda等[29]运用液相色谱-荧光法检测EC，使用高氯酸酸化样品，用9-呫吨醇对EC进行自动柱前衍生使其具有荧光性质，用荧光检测器进行捕获，进而计算出EC含量，该法检出限为0.52 μg/L，应用于葡萄酒中EC的检测，回收率为101%～103%。这种通过衍生化进行样品前处理的方法，极大地缩短了前处理时间，使样品检测前处理过程更加快速简便。
2.1.2 气相色谱 GC-MS结合了化合物的分离和鉴定，并具有高分辨率和重现性的特点。Ma等[30]建立了一种基于乙醇和K2HPO4水溶液两相系统的气相色谱-质谱联用方法，用于定量红酒中EC，研究者优化了萃取时间、温度、pH和乙醇浓度，该方法的线性工作范围是10～100 μg/L，检出限和定量限分别为2.8、9.2 μg/L。Xian等[31]建立了一种基于冰浴辅助氢氧化钠纯化的GC-MS/MS法，检测啤酒和黄酒中的EC，样品在加入内标后用乙腈-乙酸乙酯萃取，在冰浴条件下用NaOH纯化浓缩后上机检测，该法线性范围为2～200 μg/ L，检出限为0.1～0.5 μg/ kg，定量限为0.5～1.5 μg/ kg，回收率为81.5%～121.0%。赵依芃等[32]建立了稳定同位素稀释-气相色谱-串联质谱法检测乳酪、腐乳和酸奶等食品中的EC，在前处理时向样品中加入EC-d5作为内标物，该方法的检出限不超过5 ng/g，回收率在94.2%～108.3%之间。GC-MS法的灵敏度好、稳定性和回收率高，但是检测结果会受到萃取条件如溶剂、温度和时间的影响，同时样品基质和酒精含量对检测结果也有一定的影响，对低EC含量的食品检测差异性比较大。 2.1.3 薄层色谱法 黄秋婷等[33]建立了薄层色谱数码成像法，将EC直接上样至薄层板，用在磷酸创造的酸性环境下用肉桂醛对EC进行衍生，得到的衍生物能够在365 nm的激发波长下产生445～460 nm范围内的荧光，展开剂展开后在暗箱式紫外分析仪在365 nm下扫描薄层板，运用MATLAB对衍生物的荧光斑点进行积分定量，该方法的检出限为59.5 μg/L，样品加标回收率为60.12%～84.70%。该法操作方便简单，无需前处理，但由于人工上样不均匀且不同薄层板之间的差异较大，因此该法的稳定性较差。
2.2 光谱法
虽然色谱技术能够准确对痕量的EC进行定量检测，但是由于其操作复杂、成本较高，无法实现大规模快速筛查，因此，光谱技术可以作为色谱技术的补充，对EC进行半定量的筛查。常用的EC光谱检测技术主要有傅里叶变换红外光谱、核磁共振波谱和表面增强拉曼光谱等。
2.2.1 傅里叶变换红外光谱 随着化学计量学以及计算机技术的发展，研究人员将傅里叶变换红外光谱法运用在食品检测领域[34]。Manley等[35]运用软件独立建模分类法结合FTIR，对葡萄汁和葡萄酒中EC含量进行了大批量检测，虽然样品分辨率达到了80%～88%，但是样品EC实际值和检测值之间的相关性较差（r=0.47）。Lache Nmeier等[36]用傅立葉变换红外光谱仪，通过偏最小二乘回归衰减法对82个果酒样品中的EC含量进行监测，同时对比GC-MS/MS检测结果，发现FTIR检测方法定量分析的准确性较差，但由于前处理简单、检测快速方便，该方法可以作为半定量分析用于大规模筛查。
2.2.2 核磁共振波谱 Monakhova等[37]首次将核磁共振波谱技术于偏最小二乘法（PLS）结合，对112个果酒样品进行检测，核磁共振波谱提供全面的结构信息，研究者基于芳香族区域中的PLS校准进行间接定量，通过GC-MS/MS验证PLS模型的准确性，结果发现，在EC含量小于1 mg/L时，该方法能够提供可靠的EC定量分析，具有良好的灵敏度和选择性。
2.2.3 表面增强拉曼光谱 表面增强拉曼光谱法是通过检测样品吸附在金、银等粗糙表面的拉曼散射信号，从而获得待测样品信息的方法[38]。Yang等[39]以银包裹的纳米金粒子制备银星纳米颗粒作为信号放大器，可在样品中提高EC的拉曼增强作用，选取1 003 cm-1处的特征谱带用于EC定量，检出限范围为0.8～11.9 μg/L。Qi等[40]用AgNO3、抗坏血酸和聚乙烯吡咯烷酮制备了花形银纳米颗粒，将其吸移在硅片上，以785 nm为激发波长，选取857 cm-1处的特征谱带建立拉曼强度和EC浓度之间的回归模型，该方法的线性范围为10-9～10-5 mol/L，在白酒样品的检测中，回收率为89.94%～90.14%。Du等[41]将EC吸附在Ag20团簇上，形成络合物C3H7NO2-Ag20，该络合物的拉曼强度比EC常规拉曼强度增强了10倍左右，在化学与电磁场增强共同作用下，络合物的表面拉曼增强因子达到3.6×1010，因此可以看出表面增强拉曼光谱法能够对EC进行痕量检测。
2.3 其他方法
随着快检技术的发展，越来越多国内外研究者致力于EC快检方法的研究和建立，如酶法、免疫分析法以及分子印迹法等快检方法。
2.3.1 酶法 酶分析法是利用酶的特异性这一特点，对待测物进行定性和定量分析。刘丽斌等[42]发现，EC在溴水-氢氧化钠增敏处理后，对乙酰胆碱酯酶活性的抑制效果显著提高，并且在一定范围内，酶活性的抑制效果与EC的浓度线性相关，该检测方法在1～7.5 mg/L范围内线性良好，检出限为41.77 μg/L。该方法操作简单，条件温和，检测成本较低。LU等[43]建立谷氨酸脱氢酶/氨基甲酸酯降解酶的双酶偶联反应体系，根据监测NADH的浓度变化来实现对EC的定量检测，进而开发了基于双酶体系的分光光度法检测EC，在NADH在340 nm处的吸光度与EC的浓度在0.3～50 μmol/L范围内线性正相关，该法检出限为9.28 nmol/L。Zhang等[44]同样基于谷氨酸脱氢酶/氨基甲酸酯降解酶的双酶体系，将两种酶用壳聚糖和明胶包裹并固定在石墨电极表面，从而建立电流型生物传感器，该传感器的检测范围为0.4～50 μmol/L，检出限为5.30 nmol/L，测定黄酒中的EC，回收率为100%～103%。这种酶分析法是基于酶的高度专一性对EC进行定量，无需对样品前处理，易于操作，检测结果较为稳定，灵敏度较高。
2.3.2 免疫分析法 免疫分析法是基于抗原和抗体的特异性识别和可逆性结合而建立的相对高效的检测方法。马晓驰等[45]设计并合成了一种新型EC半抗原，进而制备抗原及抗血清，抗血清效价1∶10 000，对抗血清的免疫活性进行评价，灵敏度和特异性显示良好。Luo等[46]将EC用9-呫吨醇衍生化后，制备其抗原和抗体，并通过间接ELISA法检测黄酒中的EC，检出限为166 μg/L，回收率为84.4%～100.9%。在上述研究的基础上，Luo等[47]将荧光纳米硅颗粒引入ELISA的OPD-H2O2底物显色系统中，建立荧光-酶联免疫吸附法，用于检测红酒中的EC，辣根过氧化物酶催化OPD的产物DAP可以有效地猝灭纳米硅在440 nm处的发射的荧光信号，大大提升了ELISA的灵敏度，该方法的工作范围为3.9～105 μg/L，检出限为2.6 μg/ L。任勃儒[48]制备EC的抗体和抗原，用胶体金标记EC抗体，与EC人工抗原发生特异性结合，以此制备金标免疫层析试纸条用于检测发酵醋，该方法的检出限为0.5 μg/L，选择性高，无前处理过程，检测过程方便快捷、操作人员学习成本低。
2.3.3 分子印迹法 分子印迹聚合物是以待测分子为模板，通过分子印迹技术合成的物质，该聚合物具有特异性识别位点，能够对模板分子进行高效的特异性识别和选择性吸附。刘纪红等[49]以EC作为模板分子、MMA为功能单体制备了EC分子印迹聚合物，再与CdSe/CdS核壳量子点结合，制备了EC荧光分子印记复合微球，使其具有较好的荧光猝灭作用，利用该微球检测EC，检测线性范围为1 ～5 mmol/L。李曼丽[50]以EC为模板分子，PTMSO为功能单体制备了EC分子印迹聚合物，并建立了EC分子印迹电化学传感器，该方法线性范围为10-10～10-6 mol/L，检出限为3.14 nmol/L，回收率为97.2%～108%。Wu等[51]首次将SERS、固相萃取SPE与分子印迹技术结合用于检测黄酒中的EC，结果表明，该法在0～500 mg/L 范围内对黄酒中EC的含量有较好的定量能力。分子印迹法特异性强，可以排除样品基质对检测结果的影响，同时可以结合不同的检测手段，以提高检测灵敏度。 3 结论与展望
近年来，国内外研究者开发了许多EC的检测方法，各种方法在灵敏度、回收率、稳定性和便捷性上各有特色，互为补充。对于痕量检测而言，色谱法尤其是气相色譜-质谱法应用广泛，其准确性、灵敏度和检测的稳定性相较于其他方法较高，但是由于前处理过程复杂、检测成本较高，该方法无法满足大规模的现场筛查工作。因此，国内外研究者开发出了诸多其他可用于大规模筛查的快速检测方法，操作简单、便携度高，且对EC具有较好的选择性，能够达到对EC的定性和半定量检测。
发酵食品在我国日常生活中随处可见且种类繁多，国民对其质量安全也十分重视。因此，针对传统仪器检测法，应开发更加高通量、便捷快速的前处理方法，以提高检测效率;针对快检方法，排除基质效应的影响、优化现有方法并建立能够检测不同食品基质中EC的方法具有重要意义;同时，我国应当尽快出台EC在发酵食品中的限量标准，以此来促进我国发酵食品产业的健康和稳定发展。
参考文献
[1]Schmidt C F，Harer W B.The action of drugs on respiration：II.ether，chloroform，chloral，urethane，luminal，magnesium，caffeine，strychnine，and atropine[J]. Journal of Experimental Medicine，1922，37（1）：69-81.
[2]Hawkins J A，Murphy J B.The effect of ethyl urethane anesthesia on the acid-base equilibrium and cell contents of the blood[J]. Journal of Experimental Medicine，1925，42（5）：609-618.
[3]Ough C S.Ethyl carbamate in fermented beverages and foods.I.Naturally occurring ethyl carbamate[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，1976，24（2）：323-328.
[4]Canas B J，et al.Ethyl carbamate levels in selected fermented foods and beverages[J]. Journal - Association of Official Analytical Chemists，1989，72（6）：873-876.
[5]Lee K G，et al.Effect of citrulline，urea，ethanol，and urease on the formation ofn，ethyl carbamate in soybean paste model system[J]. Food Chemistry，2015，189（15）：74-79.
[6]Ough C S.Ethyl carbamate in fermented beverages and foods.II.Possible formation of ethylcarbamate from diethyl dicarbonate addition to wine[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，1976，24（2）：328-331.
[7]Haque M R，Bradbury J H.Total cyanide determination of plants and foods using the picrate and acid hydrolysis methods[J]. Food Chemistry，2002，77（1）：107-114.
[8]Zhou K，Siroli L，Patrignani F，et al.Formation of ethyl carbamate during the production process of cantonese soy sauce[J]. Molecules，2019，24（8）：1474.
[9]Anderson N，Pual S H，Henry L M.Induction of pulmonary tumors in mice with ethyl carbamate （urethane）[J]. Journal of the National Cancer Institute，1943，4 （3）：309-319.
[10]Beland F A，et al.Effect of ethanol on the tumorigenicity of urethane （ethyl carbamate）in B6C3F1 mice[J]. Food and Chemical Toxicology，2005，43（1）：19.
[11]Schlatter J，Lutz W K.The carcinogenic potential of ethyl carbamate （urethane）：risk assessment at human dietary exposure levels[J]. Food and Chemical Toxicology，1990，28（3）：205-211.
[12]Philipp H，et al.Genotoxicity of ethyl carbamate （urethane）in Salmonella，yeast and human lymphoblastoid cells[J]. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis，1997，390（1-2）：11-19. [44]Zhang Z W，Lu X X，Tian Y P，et al.High-sensitive electrochemical determination of ethyl carbamate using urethanase and glutamate dehydrogenase modified electrode[J]. Electroanalysis，2017，29（2）：481-488.
[45]马晓驰，孙玉凤，陈卫华.新型氨基甲酸乙酯人工抗原的制备与表征[J]. 食品安全质量检测学报，2020，2（11）：556-561.
[46]Luo L，et al.Development of an indirect ELISA for the determination of ethyl carbamate in Chinese rice wine[J]. Analytica Chimica Acta，2016（950）：162-169.
[47]Luo L，Song Y，Zhu C Z，et al.Fluorescent silicon nanoparticles-based ratiometric fluorescence immunoassay for sensitive detection of ethyl carbamate in red wine[J]. Sensors and Actuators B-Chemical，2018（255）：2742-2749.
[48]任勃儒.发酵醋液中氨基甲酸乙酯免疫快速检测技术研究[D].河北保定：河北大学，2016.
[49]刘纪红，杨卫海，严守雷，等.氨基甲酸乙酯荧光分子印迹微球识别机理及其荧光特性研究[J]. 食品科学，2010，31（Z1）：14-18.
[50]李曼丽.氨基甲酸乙酯的分析方法的研究[D].江苏无锡：江南大学，2016：27-36.
[51]Wu Z Z，et al.Highly sensitive determination of ethyl carbamate in alcoholic beverages by surface-enhanced Raman spectroscopy combined with a molecular imprinting polymer[J]. RSC Advances，2016，6（111）：109442-109452.
Research Advancements on Detection Methods of Ethyl Carbamate in Fermented Food
MA Xiao-chi，JIN Nuo，LIU Jia-meng，SUN Jing，JIA Ning，SUN Yu-feng*，FAN Bei*
（Institute of Food Science and Technology，Chinese Academy of Agricultural Sciences/ Key Laboratory of Agro-products Quality and Safety in Harvest，Storage，Transportation，Management and Control，MOA，Beijing 100193，China）
Abstract：Ethyl carbamate is widely found in fermented foods.In 2007，ethyl carbamate was classified as a Class 2A carcinogen by the International Agency for Research on Cancer of the World Health Organization.Researchers have developed detection methods suitable for different sample conditions and research purposes.This article reviewed the traditional and rapid methods for the detection of ethyl carbamate，including chromatography，spectroscopy，and other detection methods，and describes the application characteristics and detection results of these methods in fermented food.The development trend of ethyl ester detection technology is prospected.
Keywords：ethyl carbamate;fermented food;traditional detection;rapid detection
基金項目：国家农产品产地收贮运质量安全风险评估项目（项目编号：GJFP2019019）。
作者简介：马晓驰（1995— ），女，硕士研究生，研究方向：食品质量与安全。
共同通信作者：孙玉凤（1984— ），女，博士，副研究员，研究方向：农产品质量安全与品质评价;范蓓（1981— ），女，博士，研究员，研究方向：农产品质量与安全。