论文部分内容阅读
摘要：细菌染色体上的毒素-抗毒素（toxin-antitoxin，TA）系统通过转录水平和转录后水平调控毒素活性，从而控制细胞的生长速度和死亡，使细菌适应各种环境胁迫。为了证明集胞藻PCC 6803染色体上relNEs TA系统的转录调控，构建了以无启动子的β-半乳糖苷酶（lacZ）基因为报告基因的重组质粒，并测定含转录融合重组质粒的大肠杆菌细胞的β-半乳糖苷酶活性。结果表明，抗毒素RelN能显著抑制relNEs启动子的转录活性，而毒素RelEs能部分减弱这种抑制作用，提示relNEs系统的编码产物对该操纵子具有反馈调控作用。
关键词：集胞藻；染色体；毒素-抗毒素系统；relNEs；转录调控；转录融合重组质粒；β-半乳糖苷酶活性
中图分类号： Q756文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）09-0040-03
收稿日期：2013-12-09
基金项目：国家自然科学基金（编号：30771176）。
作者简介：孙亮华（1987—），男，河南信阳人，硕士研究生，主要从事环境微生物（蓝藻）方面的研究。E-mail：slhyspa@163.com。
通信作者：刘朝莹，博士，主要从事环境微生物学的教学研究工作。E-mail：melinka@163.com。毒素-抗毒素系统（toxin-antitoxin system，TA）由位于同一操纵子中的抗毒素基因和毒素基因构成，二者共同表达[1]。其中抗毒素基因编码不稳定的抗毒素蛋白，毒素基因编码稳定的毒素蛋白；抗毒素基因编码的毒素蛋白可被依赖ATP的蛋白酶降解成不稳定的抗毒素蛋白，与毒素蛋白相互作用形成TA复合体，可抑制毒素的细胞毒性。TA蛋白复合体可以通过抗毒素蛋白结合于TA系统中启动子的调控序列上，从而反馈调控TA系统的转录[1]。细菌染色体上的TA系统通过转录水平和转录后水平调控毒素活性，从而控制细胞的生长速度和死亡，使细菌适应各种环境胁迫[2]。蓝藻是一类古老的放氧光合细菌，具有独特的环境适应能力能和极强的生态竞争优势。集胞藻（Synechocystis） PCC6803染色体上的基因ssr1114/slr0664构成TA系统，其中slr0664为毒素基因（relEs），ssr1114为抗毒素基因（relN）[1]。抗毒素蛋白RelN与RelEs相互作用形成复合体，能够抑制毒素的毒性作用[2]。目前relNEs TA系统编码产物对其操纵子是否具有转录调控作用尚不清楚。本研究以来源于大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因（lacZ）为报告基因，构建了relNEs操纵子与lacZ的转录融合质粒，通过对含有这些质粒的重组菌株的β-半乳糖苷酶活性的分析，确定了该系统的转录调控。
1材料与方法
1.1材料与仪器
1.1.1菌株与质粒试验菌株为Escherichia coli DH5α，质粒为笔者所在实验室构建并保存。
1.1.2试剂主要试剂有：邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷（ONPG）、溴化乙锭（EB）、各类抗生素、分子生物学试剂等，均购自宝生物（大连）有限公司。引物合成及DNA测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。
1.1.3仪器主要仪器有：Mastertycler型PCR仪（Eppendorf），722型分光光度计，DY-6025型稳流稳压电泳仪，THZ-82 B型气浴恒温振荡器，HSS-1数字式超级恒温浴槽等。
1.2试验方法
1.2.1菌株、质粒的培养条件将用于质粒克隆的宿主菌Escherichia coli DH5α在37 ℃、LB培养基中培养，在含有质粒的大肠杆菌培养基中加入相应的抗生素（硫酸卡拉霉素的工作浓度为50 μg/mL，壮观霉素的工作浓度为100 μg/mL，双抗时则各自减半）。
1.2.2重组质粒的构建重组质粒的构建按分子克隆的标准方法进行。以T4 DNA聚合酶获得平末端化重组DNA。以集胞藻PCC 6803染色体为模板，用特异性引物（表1）通过PCR扩增相应的DNA片段。PCR反应体系按产品的说明设定，所用程序依反应对象设置。
2结果与分析
2.1relNEs操纵子启动子结构分析
在relNEs操纵子中，抗毒素基因relN位于毒素基因relEs上游，二者有11个核苷酸序列的重叠（ATGTCGAATAA），提示二者可能构成一个二元操纵子，在同一启动子控制下共转录。对relNEs操纵子可能的启动子区域进行分析发现，relN起始密码子（ATG）上游2个核苷酸处有公认的核糖体结合位点（RBS，GAGGAA）；上游40个核苷酸处有方向重复序列（IR，5′-TTCCGGACGGC-4N-GCCTAGATGGA-3′）；上游126个核苷酸处有启动子公认的-10序列（TCCTAAAGT），145个核苷酸处存在公认的-35序列（TTGCCA）（图1）。因此，relNEs启动子区域（PrelNEs）含有启动子的所有组分，PrelNEs可能是具有活性的启动子。此外，PrelNEs含有转录调控因子结合的IR序列，relNEs操纵子编码产物可能具有反馈调控活性。
2.2relNEs操纵子与lacZ转录融合质粒的构建
为了构建relNEs操纵子与lacZ转录融合质粒，将含relNEs启动子和relNEs编码序列的片段克隆于报告质粒pJS759[2]中无启动子的报告基因lacZ上游。分别以ssr1114-1/ssr1114-2、ssr1114-1/ssr1114-B、ssr1114-1/slr0664-X为引物，PCR扩增启动子含PrelNEs、PrelNEs-relN、PrelNEs-relN-relEs片段。将扩增产物分别正向克隆于pMD-18T中，将得到的重组质粒分别命名为pJS370、pJS396、pJS963。用PvuⅡ酶切重组质粒后，回收PrelNEs、PrelNEs-relN、PrelNEs-relN-relEs片段，并将这些回收产物分别与BglⅡ酶切后T4 DNA聚合酶补平末端的pJS759载体连接。以ssr1114-1、lacZ-R为引物，筛选PrelNEs插入方向与lacZ相同的克隆（图2），所得的重组质粒命名为pJS768、pJS769、pJS978，这些重组质粒分别含转录融合片段PrelNEs-lacZ、PrelNEs-relN-lacZ、PrelNEs-relN-relEs-lacZ（图3-A）。 2.3relNEs启动子转录活性的调控
分别用转录融合质粒pJS768、pJS769和pJS978转化E. coli DH5α，重组菌株分别命名为E. coli DH5α （pJS768）、E. coli DH5α （pJS769）、E. coli DH5α （pJS978）。以含空载体的重组质粒pJS759的菌株E. coli DH5α （pJS765）作为对照，测定各重组菌株细胞的β-半乳糖苷酶活性。图3-B结果显示，菌株E. coli DH5α （pJS768）的β-半乳糖苷酶活性显著高于对照菌株，表明启动子PrelNEs具有转录活性；E. coli DH5α （pJS769）的β-半乳糖苷酶活性显著低于E. coli DH5α （pJS768） 的β-半乳糖苷酶活性，表明RelN对启动子PrelNEs具有负调控作用；但重组菌株E. coli DH5α （pJS978）的β-半乳糖苷酶活性高于E. coli DH5α （pJS769），提示RelEs可能抑制RelN的转录抑制活性。
3讨论与结论
TA系统在转录水平和转录后水平通过降低抗毒素水平并释放毒素来激活毒素蛋白活性[1-2]。在正常的生长条件下，连续合成的抗毒素蛋白与毒素蛋白形成TA蛋白复合体，与操纵子序列结合从而抑制TA操纵子的转录。在胁迫条件下，依赖ATP的蛋白酶被激活，抗毒素被降解，TA系统的转录水平增加[1-2]。如大肠杆菌中，氨基酸饥饿激活Lon蛋白酶，并降解relBE TA系统的抗毒素蛋白，从而激活该TA系统[3-7]。已证明集胞藻PCC 6803染色体上的操纵子relNEs 编码relBE家族TA系统，其中relEs为毒素基因，relN为抗毒素基因，分别编码毒素蛋白RelEs和抗毒素蛋白RelN[1]。抗毒素蛋白RelN与RelEs相互作用形成复合体，抑制毒素的毒性作用[2]。但与大肠杆菌中的relBE同源系统不同，relNEs系统中的抗毒素可被集胞藻中的Lon和ClpXP2s降解，从而激活该系统的细胞毒性作用。
TA系统抗毒素的DNA结合结构域包括4个不同的家族：Helix-Turn-Helix （HTH）、Ribbon-Helix-Helix （RHH）、AbrB、Phd/YefM[1]。RelN与已知抗毒素无序列同源性，但二级结构分析显示， 其N末端含有类似于AbrB结构域的
β-α-β结构域，因此属于AbrB家族的转录调控因子[8-10]。本研究通过转录融合分析了relNEs操纵子的转录调控，结果显示，RelN可反馈抑制relNEs启动子的转录活性，但RelEs能抑制RelN的转录抑制活性；在relNEs启动子区域存在一个回文序列5′-TTCCGGACGGC-4N-GCCTAGATGGA-3′，推测抗毒素蛋白RelN可能通过其N末端的类-AbrB结构域与该序列结合，从而反馈抑制relNEs启动子的转录活性。由于在细胞内RelN与RelEs相互作用形成复合体[2]，推测RelN-RelEs可能部分抑制RelN与启动子中的调控序列结合的能力，从而降低RelN的转录抑制活性。但RelN与relNEs的调控序列结合活性、特异性以及蛋白酶Lon和ClpXP2s介导环境胁迫因子激活该TA系统的过程仍需进一步通过研究证明。
参考文献：
[1]常家宁，宁德刚. 蓝细菌PCC6803染色体上的一对毒素-抗毒素基因的鉴定[J]. 微生物学通报，2009，36（1）：31-36.
[2]叶森，宁德刚. 蓝细菌PCC6803染色体上的毒素蛋白Slr0664与抗毒素蛋白Ssr1114的相互作用[J]. 微生物学报，2010，50（6）：743-748.
[3]汪牧西，刘朝莹，宁德刚. 集胞藻PCC6803染色体上抗毒素-毒素基因ssl2749-sll1411的转录调控[J]. 江苏农业科学，2013，41（6）：18-20.
[4]Gerdes K，Christensen S K，Lobner-Olesen A. Prokaryotic toxin-antitoxin stress response loci.[J]. Nature Reviews Microbiology，2005，3（5）：371-382.
[5]Yamaguchi Y，Inouye M. Regulation of growth and death in Escherichia coli by toxin-antitoxin systems[J]. Nature Reviews Microbiology，2011，9（11）：779-790.
[6]Christensen S K，Mikkelsen M，Pedersen K，et al. RelE，a global inhibitor of translation，is activated during nutritional stress[J]. Proc Natl Acad of Sci USA，2001，98（25）：14328-14333.
[7]Christensen-Dalsgaard M，Jorgensen M G，Gerdes K. Three new RelE-homologous mRNA interferases of Escherichia coli differentially induced by environmental stresses[J]. Molecular Microbiology，2010，75（2）：333-348.
[8]Christensen S K，Pedersen K，Hansen F G，et al. Toxin-antitoxin loci as stress-response-elements：ChpAK/MazF and ChpBK cleave translated RNAs and are counteracted by tmRNA[J]. Journal of Molecular Biology，2003，332（4）：809-819.
[9]Gotfredsen M，Gerdes K. The Escherichia coli relBE genes belong to a new toxin-antitoxin gene family[J]. Molecular Microbiology，1998，29（4）：1065-1076.
[10]Magnuson R，Lehnherr H，Mukhopadhyay G，et al. Autoregulation of the plasmid addiction operon of bacteriophage P1[J]. The Journal of Biological Chemistry，1996，271（31）：18705-18710.
张璠，李德茂，周雨霞. 虾夷马粪海胆不同肠道中菌群组成及其PCR-DGGE图谱分析[J]. 江苏农业科学，2014，42（9）：43-45.
关键词：集胞藻；染色体；毒素-抗毒素系统；relNEs；转录调控；转录融合重组质粒；β-半乳糖苷酶活性
中图分类号： Q756文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）09-0040-03
收稿日期：2013-12-09
基金项目：国家自然科学基金（编号：30771176）。
作者简介：孙亮华（1987—），男，河南信阳人，硕士研究生，主要从事环境微生物（蓝藻）方面的研究。E-mail：slhyspa@163.com。
通信作者：刘朝莹，博士，主要从事环境微生物学的教学研究工作。E-mail：melinka@163.com。毒素-抗毒素系统（toxin-antitoxin system，TA）由位于同一操纵子中的抗毒素基因和毒素基因构成，二者共同表达[1]。其中抗毒素基因编码不稳定的抗毒素蛋白，毒素基因编码稳定的毒素蛋白；抗毒素基因编码的毒素蛋白可被依赖ATP的蛋白酶降解成不稳定的抗毒素蛋白，与毒素蛋白相互作用形成TA复合体，可抑制毒素的细胞毒性。TA蛋白复合体可以通过抗毒素蛋白结合于TA系统中启动子的调控序列上，从而反馈调控TA系统的转录[1]。细菌染色体上的TA系统通过转录水平和转录后水平调控毒素活性，从而控制细胞的生长速度和死亡，使细菌适应各种环境胁迫[2]。蓝藻是一类古老的放氧光合细菌，具有独特的环境适应能力能和极强的生态竞争优势。集胞藻（Synechocystis） PCC6803染色体上的基因ssr1114/slr0664构成TA系统，其中slr0664为毒素基因（relEs），ssr1114为抗毒素基因（relN）[1]。抗毒素蛋白RelN与RelEs相互作用形成复合体，能够抑制毒素的毒性作用[2]。目前relNEs TA系统编码产物对其操纵子是否具有转录调控作用尚不清楚。本研究以来源于大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因（lacZ）为报告基因，构建了relNEs操纵子与lacZ的转录融合质粒，通过对含有这些质粒的重组菌株的β-半乳糖苷酶活性的分析，确定了该系统的转录调控。
1材料与方法
1.1材料与仪器
1.1.1菌株与质粒试验菌株为Escherichia coli DH5α，质粒为笔者所在实验室构建并保存。
1.1.2试剂主要试剂有：邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷（ONPG）、溴化乙锭（EB）、各类抗生素、分子生物学试剂等，均购自宝生物（大连）有限公司。引物合成及DNA测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。
1.1.3仪器主要仪器有：Mastertycler型PCR仪（Eppendorf），722型分光光度计，DY-6025型稳流稳压电泳仪，THZ-82 B型气浴恒温振荡器，HSS-1数字式超级恒温浴槽等。
1.2试验方法
1.2.1菌株、质粒的培养条件将用于质粒克隆的宿主菌Escherichia coli DH5α在37 ℃、LB培养基中培养，在含有质粒的大肠杆菌培养基中加入相应的抗生素（硫酸卡拉霉素的工作浓度为50 μg/mL，壮观霉素的工作浓度为100 μg/mL，双抗时则各自减半）。
1.2.2重组质粒的构建重组质粒的构建按分子克隆的标准方法进行。以T4 DNA聚合酶获得平末端化重组DNA。以集胞藻PCC 6803染色体为模板，用特异性引物（表1）通过PCR扩增相应的DNA片段。PCR反应体系按产品的说明设定，所用程序依反应对象设置。
2结果与分析
2.1relNEs操纵子启动子结构分析
在relNEs操纵子中，抗毒素基因relN位于毒素基因relEs上游，二者有11个核苷酸序列的重叠（ATGTCGAATAA），提示二者可能构成一个二元操纵子，在同一启动子控制下共转录。对relNEs操纵子可能的启动子区域进行分析发现，relN起始密码子（ATG）上游2个核苷酸处有公认的核糖体结合位点（RBS，GAGGAA）；上游40个核苷酸处有方向重复序列（IR，5′-TTCCGGACGGC-4N-GCCTAGATGGA-3′）；上游126个核苷酸处有启动子公认的-10序列（TCCTAAAGT），145个核苷酸处存在公认的-35序列（TTGCCA）（图1）。因此，relNEs启动子区域（PrelNEs）含有启动子的所有组分，PrelNEs可能是具有活性的启动子。此外，PrelNEs含有转录调控因子结合的IR序列，relNEs操纵子编码产物可能具有反馈调控活性。
2.2relNEs操纵子与lacZ转录融合质粒的构建
为了构建relNEs操纵子与lacZ转录融合质粒，将含relNEs启动子和relNEs编码序列的片段克隆于报告质粒pJS759[2]中无启动子的报告基因lacZ上游。分别以ssr1114-1/ssr1114-2、ssr1114-1/ssr1114-B、ssr1114-1/slr0664-X为引物，PCR扩增启动子含PrelNEs、PrelNEs-relN、PrelNEs-relN-relEs片段。将扩增产物分别正向克隆于pMD-18T中，将得到的重组质粒分别命名为pJS370、pJS396、pJS963。用PvuⅡ酶切重组质粒后，回收PrelNEs、PrelNEs-relN、PrelNEs-relN-relEs片段，并将这些回收产物分别与BglⅡ酶切后T4 DNA聚合酶补平末端的pJS759载体连接。以ssr1114-1、lacZ-R为引物，筛选PrelNEs插入方向与lacZ相同的克隆（图2），所得的重组质粒命名为pJS768、pJS769、pJS978，这些重组质粒分别含转录融合片段PrelNEs-lacZ、PrelNEs-relN-lacZ、PrelNEs-relN-relEs-lacZ（图3-A）。 2.3relNEs启动子转录活性的调控
分别用转录融合质粒pJS768、pJS769和pJS978转化E. coli DH5α，重组菌株分别命名为E. coli DH5α （pJS768）、E. coli DH5α （pJS769）、E. coli DH5α （pJS978）。以含空载体的重组质粒pJS759的菌株E. coli DH5α （pJS765）作为对照，测定各重组菌株细胞的β-半乳糖苷酶活性。图3-B结果显示，菌株E. coli DH5α （pJS768）的β-半乳糖苷酶活性显著高于对照菌株，表明启动子PrelNEs具有转录活性；E. coli DH5α （pJS769）的β-半乳糖苷酶活性显著低于E. coli DH5α （pJS768） 的β-半乳糖苷酶活性，表明RelN对启动子PrelNEs具有负调控作用；但重组菌株E. coli DH5α （pJS978）的β-半乳糖苷酶活性高于E. coli DH5α （pJS769），提示RelEs可能抑制RelN的转录抑制活性。
3讨论与结论
TA系统在转录水平和转录后水平通过降低抗毒素水平并释放毒素来激活毒素蛋白活性[1-2]。在正常的生长条件下，连续合成的抗毒素蛋白与毒素蛋白形成TA蛋白复合体，与操纵子序列结合从而抑制TA操纵子的转录。在胁迫条件下，依赖ATP的蛋白酶被激活，抗毒素被降解，TA系统的转录水平增加[1-2]。如大肠杆菌中，氨基酸饥饿激活Lon蛋白酶，并降解relBE TA系统的抗毒素蛋白，从而激活该TA系统[3-7]。已证明集胞藻PCC 6803染色体上的操纵子relNEs 编码relBE家族TA系统，其中relEs为毒素基因，relN为抗毒素基因，分别编码毒素蛋白RelEs和抗毒素蛋白RelN[1]。抗毒素蛋白RelN与RelEs相互作用形成复合体，抑制毒素的毒性作用[2]。但与大肠杆菌中的relBE同源系统不同，relNEs系统中的抗毒素可被集胞藻中的Lon和ClpXP2s降解，从而激活该系统的细胞毒性作用。
TA系统抗毒素的DNA结合结构域包括4个不同的家族：Helix-Turn-Helix （HTH）、Ribbon-Helix-Helix （RHH）、AbrB、Phd/YefM[1]。RelN与已知抗毒素无序列同源性，但二级结构分析显示， 其N末端含有类似于AbrB结构域的
β-α-β结构域，因此属于AbrB家族的转录调控因子[8-10]。本研究通过转录融合分析了relNEs操纵子的转录调控，结果显示，RelN可反馈抑制relNEs启动子的转录活性，但RelEs能抑制RelN的转录抑制活性；在relNEs启动子区域存在一个回文序列5′-TTCCGGACGGC-4N-GCCTAGATGGA-3′，推测抗毒素蛋白RelN可能通过其N末端的类-AbrB结构域与该序列结合，从而反馈抑制relNEs启动子的转录活性。由于在细胞内RelN与RelEs相互作用形成复合体[2]，推测RelN-RelEs可能部分抑制RelN与启动子中的调控序列结合的能力，从而降低RelN的转录抑制活性。但RelN与relNEs的调控序列结合活性、特异性以及蛋白酶Lon和ClpXP2s介导环境胁迫因子激活该TA系统的过程仍需进一步通过研究证明。
参考文献：
[1]常家宁，宁德刚. 蓝细菌PCC6803染色体上的一对毒素-抗毒素基因的鉴定[J]. 微生物学通报，2009，36（1）：31-36.
[2]叶森，宁德刚. 蓝细菌PCC6803染色体上的毒素蛋白Slr0664与抗毒素蛋白Ssr1114的相互作用[J]. 微生物学报，2010，50（6）：743-748.
[3]汪牧西，刘朝莹，宁德刚. 集胞藻PCC6803染色体上抗毒素-毒素基因ssl2749-sll1411的转录调控[J]. 江苏农业科学，2013，41（6）：18-20.
[4]Gerdes K，Christensen S K，Lobner-Olesen A. Prokaryotic toxin-antitoxin stress response loci.[J]. Nature Reviews Microbiology，2005，3（5）：371-382.
[5]Yamaguchi Y，Inouye M. Regulation of growth and death in Escherichia coli by toxin-antitoxin systems[J]. Nature Reviews Microbiology，2011，9（11）：779-790.
[6]Christensen S K，Mikkelsen M，Pedersen K，et al. RelE，a global inhibitor of translation，is activated during nutritional stress[J]. Proc Natl Acad of Sci USA，2001，98（25）：14328-14333.
[7]Christensen-Dalsgaard M，Jorgensen M G，Gerdes K. Three new RelE-homologous mRNA interferases of Escherichia coli differentially induced by environmental stresses[J]. Molecular Microbiology，2010，75（2）：333-348.
[8]Christensen S K，Pedersen K，Hansen F G，et al. Toxin-antitoxin loci as stress-response-elements：ChpAK/MazF and ChpBK cleave translated RNAs and are counteracted by tmRNA[J]. Journal of Molecular Biology，2003，332（4）：809-819.
[9]Gotfredsen M，Gerdes K. The Escherichia coli relBE genes belong to a new toxin-antitoxin gene family[J]. Molecular Microbiology，1998，29（4）：1065-1076.
[10]Magnuson R，Lehnherr H，Mukhopadhyay G，et al. Autoregulation of the plasmid addiction operon of bacteriophage P1[J]. The Journal of Biological Chemistry，1996，271（31）：18705-18710.
张璠，李德茂，周雨霞. 虾夷马粪海胆不同肠道中菌群组成及其PCR-DGGE图谱分析[J]. 江苏农业科学，2014，42（9）：43-45.