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摘要：目的：建立斑花黄堇中总黄酮的提取和定性定量方法。方法：应用酸提碱沉法制备藏药材斑花黄堇中不同 pH 梯度下不同极性的有机溶剂二氯甲烷、 乙酸乙酯、 正丁醇生物碱浸膏; 用六种生物碱沉淀试剂对所制备的八种生物碱浸膏进行定性分析; 用标准品盐酸小檗碱制作标准品溶液的标准曲线，采用紫外分光光度法测定所提取样品溶液中生物碱成分的含量。结果：鉴定并测定出6个不同产地样品中生物碱成分的相对含量在0.49%～1.18%。 结论：通过本研究可稳定提取、定性并定量检测出藏药材斑花黄堇中生物碱成分的相对含量，该方法方便可行。
关键词：斑花黄堇;提取;总生物碱;定性鉴别;含量测定
【中图分类号】R574 【文献标识码】A 【文章编号】2107-2306（2018）06-147-03
斑花黄堇 Corydalis conspersa Maxim.，别名：甘冬欧薷（西藏藏药材名），为罂粟科紫堇属多年生草本植物，产于甘肃西南部、青海中南部、四川西北部和西藏东部和中部，是生长在海拔4300m 以上高寒流石滩中的青藏高原特色药用植物，全草用于治疗瘟疫病烧伤、赤巴病（热证）等，是重要的寒性藏药药材[1-2]。药理研究发现，罂粟科紫堇属植物具有镇痛、抗炎、抗焦虑、保肝、杀虫、抗肿瘤等活性[3-4]。研究采用酸提碱沉法提取并用有机溶剂萃取藏药材斑花黄堇中的生物碱类成分[5-8];通过生物碱鉴别试剂和通用的化学试剂对萃取的生物碱成分进行定性分析[9];应用盐酸小檗碱标准品制作标准曲线紫外分光光度法来检测藏药材斑花黄堇中相对总生物碱的含量[10]，对该品种的进一步研究和开发具有重要的意义。
1 仪器及实验材料
1.1 仪器
AL204电子天平（梅特勒—托利多仪器（上海）有限公司）
XB-5200B超声波清洗仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）
AYALA旋转蒸发仪N-1100（上海爱朗仪器有限公司）
UV-2450 紫外-可见分光光度计（岛津公司）
GZX-9096MBE数显鼓风干燥箱（上海博弈实业有限医疗设备厂）
1.2 实验材料
1.2.1 药材
斑花黄堇植物于2017年8月采自青海省黄南州吉岗山[11]，经青海民族大学药学院林鹏程教师鉴定为罂粟科紫堇属药材斑花黄堇，清洗阴干后粉碎备用。
1.2.2试剂
盐酸小檗碱对照品（质量分数>98.5%，采购于中国药品生物制品鉴定所）
盐酸、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、95%乙醇、无水乙醇、氨水、氢氧化钠、苦味酸、 钼酸铵、碘-碘化钾、碘化铋钾、浓硫酸、浓硝酸等试剂，均为分析纯
2生物碱浸膏的制备及鉴定方法和结果
2.1 制备方法及百分得率结果分析
应用 0.5%盐酸浸泡藏药材斑花黄堇药材细粉（过 80 目筛）， 超声提取三次， 每次 30 分钟， 然后抽滤并合并滤液后， 用浓氨水、 2%氢氧化钠调至不同 pH 值（pH8-9， pH10-11， pH12-13）， 静置过夜后， 用二氯甲烷、 乙酸乙酯、 正丁醇萃取碱性水液体， 获得不同 pH 值及不同极性的生物碱部位， 将各个部位的萃取液在旋转蒸发仪上浓缩并回收有机溶剂， 将浓缩后的不同 pH 值及不同极性的生物碱萃取液体放置烧杯中挥发至干， 获得不同极性的生物碱浸膏，称取重量，与总药材重量相比并乘以100%计算其百分得率。结果如表1所示，可看出：PH8～9，二氯甲烷萃取回收后总生物碱的重量得率为0.43%，最多的部分，乙酸乙酯部分得率最低，为0.19%;不同PH值，用二氯甲烷萃取部分的重量相对较多。
2.2 生物碱浸膏的鉴别反应
2.2.1 鑒别试剂的配制
（1）改良碘化铋钾溶液的配制方法
取次硝酸铋 0.85g，加冰醋酸10ml与水40ml溶解后，加碘化钾溶液（4→10） 20ml ，摇匀，即得，5 克硅钨酸溶于100 毫升水中，加盐酸至PH2左右。
（2）碘-碘化钾试剂的配制方法化学试剂的配制方法
碘酒的配方如下：碘 25g，碘化钾10g，乙醇：500mL;水：加至1000mL 配制时应先将碘化钾溶解于10mL 水中，配成饱和溶液。 再将碘加人碘化钾溶液中然后加入乙醇， 搅拌溶解后，添加蒸馏水至1000mL。
（3） 苦味酸试剂：1.5g 苦味酸溶于100ml 蒸馏水。
（4） 钼酸铵-浓硫酸配制方法
准确称取5g钼酸铵，先用少量水溶解，然后移入100ml的容量瓶中，逐渐加水至 100ml 刻度线，混匀即可。如果需要其他体积按比例增加或缩小即可。
（5） 浓硝酸：原装试剂，含量大于68%。
（6） 浓硫酸：原装试剂，含量大于98%。
2.2.2 鉴别反应方法
生物碱类成分均与多种生物碱沉淀试剂在酸性溶液（水液或稀醇液） 中产生沉淀反应。 取浸膏约 100mg， 加溶剂溶解， 依次分别滴加苦味酸试剂、钼酸铵-浓硫酸、碘-碘化钾、改良的碘化铋钾试剂、浓硝酸、浓硫酸数滴，观察颜色、气味、 沉淀等现象并拍照记录，对反应现象汇总如表2所示。
2.2.3鉴别反应汇总及分析
根据2.2.2鉴别反应的现象归纳如表2所示，可看出二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇各个部分均跟生物碱沉淀试剂和浓硝酸、浓硫酸有不同颜色的沉淀反应和褐化反应，大多为黄棕色、黑色、酒红色沉淀和溶液。
通过表2，可看出PH8～9二氯甲烷部分有明显颜色的生物碱沉淀反应，PH11乙酸乙酯有颜色，有些有沉淀，有些没有沉淀，PH12～13有颜色，有些有沉淀、有些没有沉淀，说明均不同程度的含有生物碱成分。 3 药材中生物碱成分的含量测定和结果分析
3.1 最大吸收波長的测定和结果
准确称取盐酸小檗碱标准品10mg，加 95%乙醇定容于100mL 容量瓶中，制成浓度约为0.1 mg/mL盐酸小檗碱标准溶液，摇匀备用。取盐酸小檗碱标准溶液适量，在200-700nm 范围内扫描，确定生物碱类成分盐酸小檗碱的最大吸收波长，经过扫描由图1可见盐酸小檗碱的最大吸收波长在429nm。
3.2 盐酸小檗碱标准品溶液的标准曲线制作
分别量取盐酸小檗碱0.1mg/mL标准品溶液0，2，4，6， 8，10ml，于50ml容量瓶中，用95%乙醇定容至50ml后，超声摇匀，静置后，同时以试剂空白（0ml溶液）为对照，测定在波长429nm的吸光度A，以吸光度和浓度为纵横坐标绘制标准曲线，并计算标准方程和线性关系，测定数据见表3。
通过表3的数据可得到盐酸小檗碱标准品溶液的标准曲线见图2，计算可得其回归方程为： y = 13.4x + 0.0047， 相关系数 R=0.9998。 说明盐酸小檗碱标准溶液在8-40 ug/mL 范围内具有良好的线性关系。
3.3 样品溶液的含量测定
称取药材粉末2g，于250ml圆底烧瓶中，用95%乙醇超声提取三次后抽滤定容至 100ml 容量瓶，以试剂空白为对照，于波长429nm处测定吸光度 A， 查标准曲线， 即得所取样品溶液中盐酸小檗碱生物碱成分的相对浓度，测定六份斑花黄堇根粉中的总生物碱含量，如表4所示。
4 讨论
研究中参考已有文献应用0.5%的盐酸浸提斑花黄堇藏药材粉末中的生物碱成分，用2%氢氧化钠溶液沉淀酸水溶液中所提取出的生物碱成分，调节pH值和应用不同极性有机溶剂萃取碱水溶液，分别得到不同极性的生物碱成分，方法常规且实用。然后用六种生物碱沉淀试剂和化学试剂鉴别生物碱成分，通过观察反应的现象，可看出样品均不同程度的含有生物碱成分。采用制作盐酸小檗碱标准品溶液的标准曲线，测定6份斑花黄堇藏药材中生物碱成分的相对含量，其总生物碱的含量范围在0.49%～1.18%。今后可考虑使用更加精准的方法，比如HPLC，毛细管电泳，HPLC-MS等方法在本次研究的基础上深入探讨斑花黄堇中总生物碱和各种单体成分的含量情况，开发该品种的质量评价方法并有效利用。
参考文献
[1]中国科学院植物研究所.中国植物志[M].北京：科学出版社，1999，32：36- 40.
[2]拉巴，蒋思萍.西藏植物名录[M].拉萨：西藏人民出版社，2008，20.
[3]吕芳，徐筱杰.紫堇属藏药中生物碱成分及生物活性研究进展[J].时珍国医国药，2007，（18）：67-81.
[4]于雷，张连芳，东方，等.苦豆子中主要生物碱药理作用的研究进展[J].北京联合大学学报（自然科学版），2015，20（2）：61-66.
[5]张颖，秦民坚，谢国勇. 刻叶紫堇的生物碱成分分析[J].植物资源与环境学报，2018，（19）：68-73.
[6]确生，王志波，李成思，等.响应面法优化斑花黄堇中总生物碱的提取工艺[J].中国现代应用药学，2017，34 （3）：358-362.
[7]潘国庆，张喜兵，沈国栋，等.大孔树脂法分离纯化塞北紫堇总生物碱的工艺研究[J].青海师范大学学报（自然科学版），2016，（21）：84-88.
[8]陈建平，包保全，赵红梅，等.响应面优化蒙药漏芦花中总生物碱超声提取工艺研究[J].内蒙古医科大学药学院，2005，（7）：47-52.
[9]张德华，李茹，王永梅，等.生物碱的分类和鉴定方法研究进展[J].皖西学院，2006，（22）：48-54.
[10]迟森森，韩丹，刘斌.宽筋藤总生物碱含量测定方法研究[J].西北药学杂志，2015，7（30）： 84-92.
[11]确生，陈卫东，杨红澎，林鹏程，叶菊.青海斑花黄堇藏药资源调查[J].中药材，2017，40（11）.
关键词：斑花黄堇;提取;总生物碱;定性鉴别;含量测定
【中图分类号】R574 【文献标识码】A 【文章编号】2107-2306（2018）06-147-03
斑花黄堇 Corydalis conspersa Maxim.，别名：甘冬欧薷（西藏藏药材名），为罂粟科紫堇属多年生草本植物，产于甘肃西南部、青海中南部、四川西北部和西藏东部和中部，是生长在海拔4300m 以上高寒流石滩中的青藏高原特色药用植物，全草用于治疗瘟疫病烧伤、赤巴病（热证）等，是重要的寒性藏药药材[1-2]。药理研究发现，罂粟科紫堇属植物具有镇痛、抗炎、抗焦虑、保肝、杀虫、抗肿瘤等活性[3-4]。研究采用酸提碱沉法提取并用有机溶剂萃取藏药材斑花黄堇中的生物碱类成分[5-8];通过生物碱鉴别试剂和通用的化学试剂对萃取的生物碱成分进行定性分析[9];应用盐酸小檗碱标准品制作标准曲线紫外分光光度法来检测藏药材斑花黄堇中相对总生物碱的含量[10]，对该品种的进一步研究和开发具有重要的意义。
1 仪器及实验材料
1.1 仪器
AL204电子天平（梅特勒—托利多仪器（上海）有限公司）
XB-5200B超声波清洗仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）
AYALA旋转蒸发仪N-1100（上海爱朗仪器有限公司）
UV-2450 紫外-可见分光光度计（岛津公司）
GZX-9096MBE数显鼓风干燥箱（上海博弈实业有限医疗设备厂）
1.2 实验材料
1.2.1 药材
斑花黄堇植物于2017年8月采自青海省黄南州吉岗山[11]，经青海民族大学药学院林鹏程教师鉴定为罂粟科紫堇属药材斑花黄堇，清洗阴干后粉碎备用。
1.2.2试剂
盐酸小檗碱对照品（质量分数>98.5%，采购于中国药品生物制品鉴定所）
盐酸、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、95%乙醇、无水乙醇、氨水、氢氧化钠、苦味酸、 钼酸铵、碘-碘化钾、碘化铋钾、浓硫酸、浓硝酸等试剂，均为分析纯
2生物碱浸膏的制备及鉴定方法和结果
2.1 制备方法及百分得率结果分析
应用 0.5%盐酸浸泡藏药材斑花黄堇药材细粉（过 80 目筛）， 超声提取三次， 每次 30 分钟， 然后抽滤并合并滤液后， 用浓氨水、 2%氢氧化钠调至不同 pH 值（pH8-9， pH10-11， pH12-13）， 静置过夜后， 用二氯甲烷、 乙酸乙酯、 正丁醇萃取碱性水液体， 获得不同 pH 值及不同极性的生物碱部位， 将各个部位的萃取液在旋转蒸发仪上浓缩并回收有机溶剂， 将浓缩后的不同 pH 值及不同极性的生物碱萃取液体放置烧杯中挥发至干， 获得不同极性的生物碱浸膏，称取重量，与总药材重量相比并乘以100%计算其百分得率。结果如表1所示，可看出：PH8～9，二氯甲烷萃取回收后总生物碱的重量得率为0.43%，最多的部分，乙酸乙酯部分得率最低，为0.19%;不同PH值，用二氯甲烷萃取部分的重量相对较多。
2.2 生物碱浸膏的鉴别反应
2.2.1 鑒别试剂的配制
（1）改良碘化铋钾溶液的配制方法
取次硝酸铋 0.85g，加冰醋酸10ml与水40ml溶解后，加碘化钾溶液（4→10） 20ml ，摇匀，即得，5 克硅钨酸溶于100 毫升水中，加盐酸至PH2左右。
（2）碘-碘化钾试剂的配制方法化学试剂的配制方法
碘酒的配方如下：碘 25g，碘化钾10g，乙醇：500mL;水：加至1000mL 配制时应先将碘化钾溶解于10mL 水中，配成饱和溶液。 再将碘加人碘化钾溶液中然后加入乙醇， 搅拌溶解后，添加蒸馏水至1000mL。
（3） 苦味酸试剂：1.5g 苦味酸溶于100ml 蒸馏水。
（4） 钼酸铵-浓硫酸配制方法
准确称取5g钼酸铵，先用少量水溶解，然后移入100ml的容量瓶中，逐渐加水至 100ml 刻度线，混匀即可。如果需要其他体积按比例增加或缩小即可。
（5） 浓硝酸：原装试剂，含量大于68%。
（6） 浓硫酸：原装试剂，含量大于98%。
2.2.2 鉴别反应方法
生物碱类成分均与多种生物碱沉淀试剂在酸性溶液（水液或稀醇液） 中产生沉淀反应。 取浸膏约 100mg， 加溶剂溶解， 依次分别滴加苦味酸试剂、钼酸铵-浓硫酸、碘-碘化钾、改良的碘化铋钾试剂、浓硝酸、浓硫酸数滴，观察颜色、气味、 沉淀等现象并拍照记录，对反应现象汇总如表2所示。
2.2.3鉴别反应汇总及分析
根据2.2.2鉴别反应的现象归纳如表2所示，可看出二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇各个部分均跟生物碱沉淀试剂和浓硝酸、浓硫酸有不同颜色的沉淀反应和褐化反应，大多为黄棕色、黑色、酒红色沉淀和溶液。
通过表2，可看出PH8～9二氯甲烷部分有明显颜色的生物碱沉淀反应，PH11乙酸乙酯有颜色，有些有沉淀，有些没有沉淀，PH12～13有颜色，有些有沉淀、有些没有沉淀，说明均不同程度的含有生物碱成分。 3 药材中生物碱成分的含量测定和结果分析
3.1 最大吸收波長的测定和结果
准确称取盐酸小檗碱标准品10mg，加 95%乙醇定容于100mL 容量瓶中，制成浓度约为0.1 mg/mL盐酸小檗碱标准溶液，摇匀备用。取盐酸小檗碱标准溶液适量，在200-700nm 范围内扫描，确定生物碱类成分盐酸小檗碱的最大吸收波长，经过扫描由图1可见盐酸小檗碱的最大吸收波长在429nm。
3.2 盐酸小檗碱标准品溶液的标准曲线制作
分别量取盐酸小檗碱0.1mg/mL标准品溶液0，2，4，6， 8，10ml，于50ml容量瓶中，用95%乙醇定容至50ml后，超声摇匀，静置后，同时以试剂空白（0ml溶液）为对照，测定在波长429nm的吸光度A，以吸光度和浓度为纵横坐标绘制标准曲线，并计算标准方程和线性关系，测定数据见表3。
通过表3的数据可得到盐酸小檗碱标准品溶液的标准曲线见图2，计算可得其回归方程为： y = 13.4x + 0.0047， 相关系数 R=0.9998。 说明盐酸小檗碱标准溶液在8-40 ug/mL 范围内具有良好的线性关系。
3.3 样品溶液的含量测定
称取药材粉末2g，于250ml圆底烧瓶中，用95%乙醇超声提取三次后抽滤定容至 100ml 容量瓶，以试剂空白为对照，于波长429nm处测定吸光度 A， 查标准曲线， 即得所取样品溶液中盐酸小檗碱生物碱成分的相对浓度，测定六份斑花黄堇根粉中的总生物碱含量，如表4所示。
4 讨论
研究中参考已有文献应用0.5%的盐酸浸提斑花黄堇藏药材粉末中的生物碱成分，用2%氢氧化钠溶液沉淀酸水溶液中所提取出的生物碱成分，调节pH值和应用不同极性有机溶剂萃取碱水溶液，分别得到不同极性的生物碱成分，方法常规且实用。然后用六种生物碱沉淀试剂和化学试剂鉴别生物碱成分，通过观察反应的现象，可看出样品均不同程度的含有生物碱成分。采用制作盐酸小檗碱标准品溶液的标准曲线，测定6份斑花黄堇藏药材中生物碱成分的相对含量，其总生物碱的含量范围在0.49%～1.18%。今后可考虑使用更加精准的方法，比如HPLC，毛细管电泳，HPLC-MS等方法在本次研究的基础上深入探讨斑花黄堇中总生物碱和各种单体成分的含量情况，开发该品种的质量评价方法并有效利用。
参考文献
[1]中国科学院植物研究所.中国植物志[M].北京：科学出版社，1999，32：36- 40.
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[4]于雷，张连芳，东方，等.苦豆子中主要生物碱药理作用的研究进展[J].北京联合大学学报（自然科学版），2015，20（2）：61-66.
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[6]确生，王志波，李成思，等.响应面法优化斑花黄堇中总生物碱的提取工艺[J].中国现代应用药学，2017，34 （3）：358-362.
[7]潘国庆，张喜兵，沈国栋，等.大孔树脂法分离纯化塞北紫堇总生物碱的工艺研究[J].青海师范大学学报（自然科学版），2016，（21）：84-88.
[8]陈建平，包保全，赵红梅，等.响应面优化蒙药漏芦花中总生物碱超声提取工艺研究[J].内蒙古医科大学药学院，2005，（7）：47-52.
[9]张德华，李茹，王永梅，等.生物碱的分类和鉴定方法研究进展[J].皖西学院，2006，（22）：48-54.
[10]迟森森，韩丹，刘斌.宽筋藤总生物碱含量测定方法研究[J].西北药学杂志，2015，7（30）： 84-92.
[11]确生，陈卫东，杨红澎，林鹏程，叶菊.青海斑花黄堇藏药资源调查[J].中药材，2017，40（11）.