研究背景与目的：原癌基因bmi-1（bmi-1）是PcG（PcG）家族成员之一，它直接参与细胞生长、增殖的调节。研究证实人类多种肿瘤的发生、发展过程均与bmi-1基因表达异常有关，且与多种肿瘤的预后相关。RNA干扰技术是当前研究热点，特定基因的小干扰RNA能在不影响细胞正常基因功能的前提下，沉默肿瘤相关基因从而起到基因治疗的作用。RNAi技术的应用领域已经从基因组学研究逐步扩展到医学领域并作为基因治疗手段。利用RNAi不仅能提供一种经济、快捷、高效的抑制基因表达的技术手段，而且有可能在基因功能测定和基因治疗等方面开辟一条新思路。 本实验构建针对bmi-1基因的shRNA表达载体，首先采取脂质体介导转染法将带有荧光标记的pEGFP-N1转染大肠癌细胞初步判断转染效率及最适转染细胞；再将构建好的shRNA表达载体经脂质体介导转染LoVo细胞系，用嘌呤霉素筛选获得稳定转染LoVo细胞系，经荧光定量RT-PCR、Western Blot观察shRNA表达载体是否抑制lovo细胞bmi-1 mRNA与蛋白表达，经MTT与凋亡染色观察shRNA表达载体对癌细胞生长、凋亡的影响。本实验旨在bmi-1高表达的肿瘤中，探索能特异性封闭bmi-1的表达，将可能为肿瘤的基因治疗提供新靶点，进一步为临床肿瘤基因治疗提供理论依据。 方法： 1．RT-PCR检测bmi-1基因在大肠癌组织与癌旁对照组织中的表达，凝胶成像系统灰度扫描分析bmi-1基因在大肠癌组织与癌旁对照组织中的表达情况。 2．根据siRNA设计原则，设计靶向bmi-1小干扰RNA互补寡核苷酸链及无义对照序列。 3．将重组载体pSIREN-VEGF-C用内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ进行双酶切，电泳鉴定后行胶回收获得线性化pSIREN-RetroQ载体。 4．将单链退火形成互补双链后与线性载体连接，构建重组逆转录病毒载体pSIREN-bmi-1-2及无义对照序列构建成的pSIREN-bmi-1．C；挑取LB平板上的阳性单克隆，双酶切鉴定正确后送生物公司测序。 5．大肠癌细胞按照常规贴壁肿瘤细胞培养，并梯度筛选出最佳嘌呤霉素浓度用于筛选稳定转染细胞。 6．用脂质体介导转染法将带有荧光标记的pEGFP-N1空质粒转染四种不同大肠癌细胞，初步判断转染效率及最适转染细胞。 7．采用脂质体介导转染法，将逆转录病毒载体pSIREN-bmi-1-1（实验室保存）、pSIREN-bmi-1-2及无义对照载体pSIREN-bmi-1-C分别转染大肠癌细胞，用嘌呤霉素筛选稳定转染的单克隆细胞，扩增培养。 8．荧光定量RT-PCR检测转染载体前后bmi-1基因在mRNA水平的表达情况。 9．Western Blot法检测载体转染前后细胞bmi-1蛋白表达的变化。 10．用MTT比色法检测pSIREN-bmi-1-1、pSIREN-bmi-1-2、pSIREN-bmi-1-C及空白对照组间增殖能力，并从形态学上观察pSIREN-bmi-1-1、pSIREN-bmi-1-2、pSIREN-bmi-1-C及空白对照组间的差异。 11．用AnnexinⅤ与PI双染法染色观察pSIREN-bmi-1-1、pSIREN-bmi-1-2、pSIREN-bmi-1-C及空白对照组间凋亡情况。 结果： 1．RT-PCR的表达研究显示bmi-1 mRNA在癌组织中的表达高于相应癌旁组织，平均表达率为0．76±0．23、0．35±0．19。 2．利用分子克隆技术构建了重组逆转录病毒载体pSIREN-bmi-1-2及psIREN-bmi-1-C，重组载体经酶切电泳和测序鉴定，证实插入片段的大小、方向均与设计的一致。 3．在四种不同大肠癌细胞株中，经脂质体介导转染法将带有荧光标记的pEGFP-N1空质粒转染大肠癌细胞LoVo可获得较高的转染效率，其转染效率约为50％。 4．嘌呤霉素筛选稳定转染的单克隆大肠癌细胞的最佳剂量为5ug/ml。 5．荧光定量RT-PCR检测bmi-1 mRNA水平的表达情况，结果显示：pSIREN-bmi-1-2组bmi-1 mRNA水平与pSIREN-bmi-1-C及空白对照组相比，表达水平显著降低，bmi-1 mRNA表达抑制率为80％，差异有统计学意义，而pSIREN-bmi-1-1、pSIREN-bmi-1-C与空白对照组之间两两相比，bmi-1 mRNA表达水平差异没有统计学意义。 6．Western Blot检测bmi-1蛋白水平的表达研究显示：bmi-1在pSIREN-bmi-1-2组的蛋白表达低于其它三组的表达，bmi-1蛋白表达受抑制，抑制率为82％；但在pSIREN-bmi-1-1、pSIREN-bmi-1-C、空白对照组的蛋白表达无明显差异，可见重组质粒pSIREN-bmi-1-2能够抑bmi-1在蛋白水平的表达，而重组质粒pSIREN-bmi-1-1不具有此作用。 7．细胞生长曲线显示：MTT比色法结果表明pSIREN-bmi-1-2组细胞与其它三组细胞比较生长缓慢，而pSIREN-bmi-1-1组、pSIREN-bmi-1-C组对细胞生长没有影响。 8．形态学检测各重组载体与空白对照组在细胞形态学上无明显差异。 9．细胞凋亡分析显示各重组载体与空白对照组比较，不引起细胞凋亡。 结论： 1．半定量RT-PCR显示bmi-1基因在大肠癌组织的表达高于癌旁组织。 2．重组载体pSIREN-VEGF-C经双酶切电泳鉴定后行胶回收获得了线性化载体pSIREN-RetroQ，并成功构建了重组逆转录病毒载体pSIREN-bmi-1-2及pSIREN-bmi-1-C。 3．在四种大肠癌细胞株中，采用脂质体介导转染法易于将外源质粒转入的是LoVo细胞。 4．pSIREN-bmi-1-1、pSIREN-bmi-1-2中，重组载体pSIREN-bmi-1-2抑制了bmi-1基因在LoVo细胞中mRNA、蛋白水平的表达，并能够抑制LoVo细胞的增殖，但未引起明显细胞形态改变，亦不能引起明显的细胞凋亡；而重组载体pSIREN-bmi-1-1不能抑制靶基因的表达与增殖。