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研究目的:动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是大中动脉较常见的慢性脂质代谢性疾病。氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,oxLDL)等脂质成分刺激导致的细胞功能异常被认为是AS的病理进程中的关键因素。研究显示,抗磷脂综合征(antiphospholipid syndrome,APS)等自身免疫性疾病与AS的发生存在联系。APS中的自身抗原β2糖蛋白I(beta 2 glycoprotein I,β2GPI)可以通过与oxLDL形成复合物,加强oxLDL的致病作用[1]。此外,抗β2GPI抗体也被证实能够与oxLDL结合,加强oxLDL介导的细胞损伤[2]。Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)是介导抗磷脂综合征炎症的主要模式识别受体,其在AS的病理进程中也起到重要作用[3-5]。激活TLR4可以使内皮细胞和迁移入内膜下的平滑肌细胞高表达单核细胞趋化因子1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1),并通过促进单核细胞黏附来加速AS的炎症进程[6-7]TLR4还通过诱导平滑肌细胞(smooth muscle cell,SMC)高表达基质金属蛋白酶9(matrixmetallopeptidase9,MMP-9),该蛋白通过降解外基质促进SMC向内膜下的迁移[8]。进入内膜下的SMC吞噬oxLDL等脂质成分成为泡沫细胞并参与AS斑块的形成[9-10]。尽管单独的β2GPI、抗β2GPI抗体以及oxLDL/β2GPI复合物在AS中的作用已经得到了较为广泛的报道,但氧化型低密度脂蛋白/β2糖蛋白1/抗β2糖蛋白I抗体(oxLDL/β2GPI/anti-β2GPI antibody,oxLDL/β2GPI/β2GPI-Ab)复合物在AS病理进程中的作用仍有待进一步探讨。本组前期研究发现,oxLDL/β2GPI/β2GPI-Ab复合物能够通过TLR4依赖的方式促进内皮细胞分泌白细胞介素1β(interleukin-1 β,IL-1β)、MCP-1等促炎因子[11],并上调巨噬细胞的泡沫化以及炎症因子表达[12]。本研究主要是观察oxLDL/β2GPI/β2GPI-Ab复合物对大鼠胸主动脉平滑肌细胞株A7r5的趋化、迁移、脂质积累等功能的影响和TLR4信号通路在其中发挥的作用。研究方法:(1)划痕实验(Wound-Healing Assay)观察经无血清培养基(media)、oxLDL、oxLDL/β2GPI 复合物、β2GPI-Ab、β2GPI/β2GPI-Ab 复合物、oxLDL/β2GPI/β2GPI-Ab复合物处理后A7r5细胞的迁移,并用Image J 1.44软件定量分析细胞迁移距离。(2)media、oxLDL、oxLDL/β2GPI 复合物、β2GPI-Ab、β2GPI/β2GPI-Ab复合物、oxLDL/β2GPI/β2GPI-Ab复合物处理A7r5细胞后,采用实时荧光定量PCR检测A7r5细胞中MCP-1、MMP-9、乙酰辅酶A乙酰基转移酶 1(acetyl-CoAacetyltransferasel,ACATl)的 mRNA 水平;酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测培养上清中MCP-1、MMP-9的蛋白水平。(3)为探究上述过程中TLR4的作用,利用TAK-242预处理A7r5细胞,经 media、oxLDL、oxLDL/β2GPI 复合物、β2GPI-Ab、β2GPI/β2GPI-Ab复合物、oxLDL/β2GPI/β2GPI-Ab复合物刺激后,RT-qPCR检测ACAT1、MCP-1、MMP-9的mRNA表达,ELISA检测细胞上清液MCP-1、MMP-9的蛋白水平表达。(4)Trinder 法检测 media、oxLDL、oxLDL/β2GPI/β2GPI-Ab 复合物刺激后的,经和未经TAK-242预处理的A7r5细胞的总胆固醇(total cholesterol,TC)、游离胆固醇(free cholesterol,FC)的含量,并用TC、FC差值来计算胆固醇酯(cholesterylester,CE)的含量。研究结果:(1)经oxLDL/β2GPI/β2GPI-Ab复合物刺激组中的A7r5细胞迁移最为明显(68.33±3.12 μm),两侧细胞基本贴合。与media组相比差异具有统计学意义(p<0.05)。经 TAK-242 预处理后,oxLDL/β2GPI/β2GPI-Ab 复合物组迁移距离相较于未经处理时明显缩短(P<0.05)(2)经 oxLDL/β2GPI/β2GPI-Ab 复合物处理后,MCP-1、MMP-9 的 mRNA 水平和蛋白表达水平增加,相较于media差异显著(p<0.05)。经TAK-242预处理后,oxLDL/β2GPI/β2GPI-Ab 复合物组 MCP-1、MMP-9 的 mRNA表达相较于未经处理时明显降低(P<0.05)。(3)经oxLDL/β2GPI/β2GPI-Ab复合物处理后,A7r5的TC、FC、CE含量相较于media组明显增加(P<0.05),同时ACAT1的mRNA水平也表达增加(P<0.05)。经TAK-242预处理后,ACAT1的表达和胞内TC、FC的含量相较于未经TAK-242处理组明显受到抑制(P<0.05)。结论:(1)oxLDL/β2GPI/β2GPI-Ab复合物引起A7r5迁移相关分子MMP-9表达增高,并促进细胞迁移,提示oxLDL/β2GPI/β2GPI-Ab复合物在AS相关的SMC迁移中发挥重要作用。阻断TLR4能够显著抑制这一趋势,提示TLR4为其中重要的信号分子。(2)oxLDL/β2GPI/β2GPI-Ab复合物引起A7r5趋化因子MCP-1表达增高,提示oxLDL/β2GPI/β2GPI-Ab复合物在AS相关的SMC趋化中发挥重要作用。阻断TLR4能够显著抑制这一趋势,提示TLR4为其中重要的信号分子。(3)oxLDL/β2GPI/β2GPI-Ab复合物促进A7r5的胞内胆固醇积累与ACAT1的表达,且该现象在经TAK-242预处理后受到明显抑制,提示oxLDL/β2GPI/β2GPI-Ab复合物能有效促进A7r5脂质积累,且该过程中有TLR4信号的参与。