论文部分内容阅读
在我国,胃癌(gastric carcinoma,GC)是一种高死亡率的恶性肿瘤。临床上,大部分胃癌患者病程早期的自觉症状并不明显,往往就诊时已经伴有转移。虽然医学技术不断地发展,但是胃癌的检查和治疗手段仍然受到许多因素的限制。胃癌细胞对放化疗不敏感,易转移复发。因此,研究胃癌发生的分子机制,有助于建立新的胃癌诊断标志物,发现新的治疗靶点。MicroRNA(miRNA)是一类约22(21～25)个核苷酸的非编码单链RNA分子,在调节基因功能方面有着重要作用。miRNA功能失调与多种肿瘤的发生和生物学行为有关,包括增殖、转移、血管生成和免疫逃逸等。miR-144在多种肿瘤细胞中具有抑癌作用,可调节肿瘤上皮间质转化。但目前有关于miR-144与胃癌关系的报道并不多见。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)属于磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)相关激酶(PIKKs)家族成员,具有类似于脂质激酶PI3K的C-末端蛋白激酶结构域。mTOR与肿瘤的发生发展过程密切相关。mTOR在多种实体肿瘤中高表达,通过激活核糖体激酶,促进肿瘤细胞的增殖、存活和侵袭转移等。miR-144与mTOR在人胃癌组织中的表达水平呈负相关。然而,两者在胃癌中的相互作用尚不清楚。我们前期研究发现,中草药南蛇藤茎乙酸乙酯提取物(Celastrus Orbiculatus ethylacetate extract,COE)具有较强的抗肿瘤活性,但具体的作用机制尚未完全明了。为了探索南蛇藤提取物是否协同miR-144靶向mTOR抑制胃癌,本文首先检测了miR-144在胃癌组织样本中的表达水平;然后,通过瞬时转染技术,构建高表达miR-144的人胃癌MGC803细胞株,研究miR-144与mTOR蛋白的关系;最后,南蛇藤提取物干预后,研究药物对胃癌细胞的增殖和迁移能力的影响,进一步探索其分子作用机制。本研究分为以下三个部分:第一章人胃癌组织中miR-144的表达水平目的:检测人胃癌组织标本中miR-144的表达水平。方法:20例胃癌患者,来自于扬州大学附属医院,均经病理学检查确诊为胃恶性肿瘤。实时荧光定量PCR法,检测胃癌组织miR-144(包括miR-144-3p和miR-144-5p)的表达量,以相应的癌旁正常组织作为阴性对照。结果:胃癌组织中miR-144-3p和miR-144-5p的2-ΔΔCT值分别是癌旁组织的24.0%和20.3%。该结果表明,与癌旁组织相比,胃癌组织中miR-144的表达量显著降低(P<0.05)。结论:MiR-144在胃癌组织中的表达水平明显减少。第二章人胃癌MGC803/miR144+细胞的构建及miR-144与mTOR的相互关系目的:构建高表达miR-144的人胃癌MGC803细胞株,并探讨miR-144与mTOR信号通路之间的相互关系。方法:人胃癌MGC803细胞体外培养至对数期。通过瞬时转染技术,将高表达的miR-144质粒转染至人胃癌MGC803细胞中,设立空白载体对照组和野生细胞阴性对照组。质粒转染48 h后,在倒置荧光显微镜下,观察细胞的绿色荧光表达情况。收集细胞并提取总RNA,使用qRT-PCR技术,检测miR-144和mTOR mRNA的表达量。同时,运用 Western blot 法,检测 MGC803/miR144、细胞中 mTOR、p-mTOR、PI3K、AKT、4EBP1和p-4EBP1蛋白的表达水平。结果:质粒转染48h后,在倒置荧光显微镜下,MGC803/miR144+细胞中绿色荧光信号明显增强。qRT-PCR结果显示,MGC803/miR144+细胞中,miR-144表达水平明显高于对照组(P<0.05),而mTOR mRNA的表达量明显减少(P<0.05)。Western blot结果显示,mTOR、p-mTOR、PI3K、AKT、4EBP1及p-4EBPI的蛋白表达量均明显降低(P<0.05)。结论:1、成功构建人胃癌MGC803/miR144+细胞株。2、在胃癌细胞中,miR-144可能通过降低mTOR的表达水平,发挥抑癌因子的作用。第三章南蛇藤提取物对人胃癌MGC803/miR-144+细胞增殖和迁移能力的影响目的:观察南蛇藤提取物(COE)对MGC803/miR-144+细胞增殖和迁移能力的影响。方法:对数生长期的人胃癌MGC803/miR-144+细胞中,加入不同浓度的COE(20,40,80,160,320 μg·mL-1)。各组药物作用 24 h 后,利用 MTT 法,检测 MGC803/miR-144+细胞的增殖率,根据半数抑制浓度(IC50)。同时设立空白质粒对照组、不加药阴性组和阳性对照组(5-Fu,50 μg.mL-1)。细胞划痕实验分析迁移能力,Western blot检测上皮间质转化(EMT)相关蛋白(N-cadherin、Vimentin及E-cadherin)的表达差异性。结果:药物作用24 h后,MGC803/miR-144+细胞的增殖能力受抑制,并呈一定的浓度依赖性(P<0.05)。经计算,其半数抑制浓度(IC50)约为126.86μg.mL-1。细胞划痕实验结果显示,与空质粒对照组细胞相比较,高表达miR-144的人胃癌MGC-803细胞的迁移能力明显受抑制。各用药组之间进行对比,与未经药物作用的细胞相较,南蛇藤提取物明显抑制人胃癌MGC803/miR-144+细胞的迁移能力(P<0.05)。COE可显著增加E-cadherin的蛋白表达量(P<0.05),降低N-cadherin和Vimentin蛋白的表达量(P<0.05)。结论:南蛇藤提取物可抑制MGC803/miR-144+细胞的增殖和迁移能力,其机制可能与上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关。