加减益经汤对DOR患者卵巢功能影响的临床研究目的:通过对肾虚肝郁型卵巢功能减退(diminished ovarian reserve,DOR)患者给予加减益经汤治疗后的临床观察,研究加减益经汤对DOR患者的临床疗效以及相关的作用机制。方法:采用随机对照的试验方法,将符合标准的研究对象共73例,随机分为中药组(加减益经汤组)37例,西药组(雌孕激素序贯疗法组)36例;其中中药组剔除4例,西药组剔除3例;实际中药组完成33例,西药组完成33例。中药组:月经干净后第一天开始服用加减益经汤,经期停服,下次月经干净后第一天再服用下一周期,共治疗6个月经周期(若超过40天月经未来潮,则停服加减益经汤,改服地屈孕酮片20mg/d×10d)。西药组:从月经周期或药物撤退性出血第5天始予补佳乐2mg/d×21d+地屈孕酮片20mg/d× 10天(地屈孕酮片于服用补佳乐的第12天开始加服),月经再次来潮的第5天始服下一周期(如月经未来潮,停药后的第8天再服用下一周期),共治疗6个月经周期。观察比较两组患者治疗前后血清bFSH、bLH、bE2、AMH,INHB-ACTA-FS系统,超声下AFC、卵巢体积,中医症候积分,及两组妊娠率的变化。结果:1.通过两组年龄、孕次、产次、病程、治疗前中医症状积分等基线的比较,及治疗前两组妇女血清学指标、及超声检查结果比较,发现差异均无统计学意义(P>0.05)。2.两组bFSH、bLH、bE2比较:中药组和西药组治疗前bFSH、bLH、bE2相比差异没有统计学意义(P>0.05)。中药组和西药组治疗后bFSH、bLH均较治疗前明显下降,而bE2较治疗前明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01),中药组和西药组治疗后bFSH、bLH相比差异均无统计学意义(P>>0.05),西药组治疗后bE2与中药组治疗后比较明显升高,差异有统计学意义(P<0.01)。3.两组AMH比较:中药组和西药组治疗前AMH相比差异没有统计学意义(P>0.05)。中药组和西药组治疗后AMH均较治疗前明显升高,差异有统计学意义(P<0.01),中药组和西药组治疗后AMH相比差异均无统计学意义(P>0.05)。4.两组妇女INHB、ACTA、FS比较:中药组和西药组治疗前INHB、ACTA、FS相比差异均没有统计学意义(P>0.05)。中药组和西药组治疗后INHB、FS均较治疗前明显升高,ACTA均较治疗前明显降低,差异均有统计学意义(P<0.01)。中药组和西药组治疗后INHB、FS、ACTA相比差异均无统计学意义(P>0.05)。5.两组超声结果比较:中药组和西药组治疗前卵巢体积、AFC相比差异均没有统计学意义(P>0.05)。中药组和西药组治疗后AFC均较治疗前明显升高,差异有统计学意义(P<0.01),中药组和西药组治疗后卵巢体积与治疗前相比差异无统计学意义(P>0.05),中药组和西药组治疗后卵巢体积、AFC相比差异无统计学意义(P>0.05)。6.两组中医证候积分比较:中药组和西药组治疗前各中医症候积分相比差异均没有统计学意义(P>0.05)。中药组和西药组治疗后"月经周期、月经量、月经质、性欲减退、烦躁易怒、精神抑郁"积分均较治疗前明显降低,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);西药组治疗后"月经周期"积分与中药组治疗后比较明显下降,差异有统计学意义(P<0.05);中药组治疗后"头晕耳鸣、乳房胀痛、腰膝酸软"积分与治疗前比较明显降低,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);西药组治疗后"头晕耳鸣、乳房胀痛、腰膝酸软"积分与治疗前比较,差异无统计学意义(P>0.05);中药组治疗后"头晕耳鸣、乳房胀痛、腰膝酸软"积分与西药组治疗后比较明显下降,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。7.两组治疗后妊娠率的比较:两组中不孕症患者均有9例,治疗后中药组妊娠3例,西药组妊娠1例,虽然两组的妊娠率比较差异无统计学意义(P>0.05),但中药组妊娠例数高于西药组。8.两组疗效比较:中药组和西药组治疗后疗效指数总有效率比较差异无统计学意义(P>0.05),两者疗效指数分布比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:1.肾虚肝郁证型是DOR的常见病机,补肾疏肝法是治疗肾虚肝郁型DOR患者的有效的治法。加减益经汤可以降低肾虚肝郁型DOR患者血清FSH、LH的水平,升高E2、AMH水平及增加AFC,从而改善肾虚肝郁型DOR患者的卵巢功能,并且与雌孕激素序贯疗法疗效相似。2.加减益经汤和雌孕激素序贯疗法均可以改善DOR患者月经状况,包括调整月经周期,增加月经过少患者的月经量,都能改善患者性欲减退、烦躁易怒、情志抑郁的等症状,而在改善患者头晕耳鸣、腰膝酸软及乳房胀痛等症状方面,加减益经汤明显优于西药雌孕激素序贯疗法,且无明显的不良副作用。且加减益经汤能够使部分不孕症患者妊娠。因此,对于需要怀孕或者有激素使用禁忌症的患者,加减益经汤是更合适的选择。3.INHB-ACTA-FS系统功能与卵巢功能密切相关,加减益经汤及雌孕激素序贯疗法均能够改善INHB-ACTA-FS系统功能,即升高患者血清INHB、FS水平及降低ACTA水平。由此推测加减益经汤可能能够通过改善血清INHB-ACTA-FS系统旁/自分泌行为,并调节TGF-β超家族相关成员促进卵泡的成熟,进而改善卵巢功能。加减益经汤对卵巢功能减退模型大鼠INHB-ACTA-FS系统及卵巢凋亡细胞因子的影响目的:为研究加减益经汤治疗卵巢功能减退(DOR)的作用机制,用加减益经汤高剂量组、中剂量组、低剂量组及对照药物补佳乐干预DOR模型大鼠,通过检测观察大鼠血清中性激素水平、抑制素B(INHB)-激活数A(ACTA)-卵泡抑制素(FS)的水平和大鼠卵巢组织上AMH和Bcl-2/Bax的表达水平的变化,来探索加减益经汤治疗DOR的疗效与作用机理,为临床上加减益经汤治疗DOR提供理论依据。方法:1.采用前瞻性随机对照的研究方法,选取正常的SPF级成年雌性SD大鼠360只随机分为空白对照组、模型对照组、加减益经汤高、中、低剂量组、补佳乐组(模型组和各治疗组按环磷酰胺(CTX))75mg·kg-1造模,空白对照组采用同等体积的生理盐水造模),分别灌胃等体积生理盐水、等体积生理盐水、0.09mg· kg-1补佳乐、23.58g · kg-1加减益经汤、5.895g · kg-1加减益经汤,连续灌胃4周,分别于灌胃给药后的第1、2、3、4、6、8周,每组均处死十只处于动情间期的雌性大鼠。2.观察大鼠的的一般情况3.酶联免疫吸附技术(ELISA)检测各组大鼠血清FSH、LH、E2、AMH、INHB、ACTA、FS的水平,免疫组化法(IHC)检测大鼠卵巢组织Bcl-2、Bax、AMH的表达水平。结果:1.造模成功经CTX造模后,各造模组大鼠均出现精神萎靡、蜷缩弓背、被毛稀松、无光泽,活动次数减少、四肢乏力、行动困难、呼吸短促、反应迟钝、摄食和摄水量明显下降,大便溏薄、小便清长等表现,解剖大鼠时均发现有不同程度的内脏淤血现象,与大鼠肾虚肝郁、脾虚血瘀的生理表现相符,提示DOR大鼠模型造模成功。空白组的大鼠一般情况良好,精神良好、体毛光滑柔顺、摄食及摄水正常、活动自如、反应敏捷、大小便正常。加减益经汤高、中、低剂量组及补佳乐组,在给药4w后,大鼠的外观体征、行为活动、精神状态、大小便形状颜色等恢复正常,与空白对照组大鼠无差异。2.动情周期的变化造模后,大鼠的动情周期发生改变,由4～5d延长为7～16d,动情间期时间由1.5～2.5d延长至5～7d,大鼠动情周期在造模后第6w恢复正常;加减益经汤高、中剂量组、补佳乐组大鼠动情周期在造模后第4w恢复正常;加减益经汤低剂量组大鼠动情周期在造模后第6w恢复正常。3.FSH的变化在造模后第1w、2w、3w、4w、6w、8w,模型对照组的大鼠血清FSH的水平与空白对照组比较均有不同程度的升高,差异有统计学意义(P<0.01);模型对照组组内各w比较差异有统计学意义(P<0.01),模型对照组大鼠血清FSH水平第4w、第6w、第8w与第1w比较明显降低,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。与模型对照组比较,加减益经汤高、中剂量组大鼠血清FSH水平在造模后第1w开始降低,持续降低至第8W,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);补佳乐组与加减益经汤低剂量组大鼠血清FSH水平在造模后第2w开始明显降低(P<0.05),持续降低至第4w(P<0.05)。与空白对照组比较,加减益经汤高、中剂量组及补佳乐组大鼠血清FSH水平在造模后第4w恢复至正常水平(P>0.05);加减益经汤低剂量组第6w恢复正常(P>0.05)。4.LH的变化在造模后第1w、2w、3w、4w、6w、8w,模型对照组的大鼠血清LH的水平与空白对照组比较均升高,差异有统计学意义(P<0.01);模型对照组大鼠血清LH水平第6w、第8w与第1w比较明显降低,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。与模型对照组比较,治疗各组大鼠血清LH水平在造模后第2w开始降低,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01),加减益经汤高、中剂量组持续降低至第8w;补佳乐组持续降低至第6w,加减益经汤低剂量组持续降低至第4w。与空白对照组比较,加减益经汤高、中剂量组和补佳乐组大鼠血清LH水平在第2w恢复至正常水平(P>0.05);加减益经汤低剂量组在第3w恢复至正常水平(P>0.05)。5.E2的变化在造模后第1w、2w、3w、4w、6w、8w,模型对照组的大鼠血清E2的水平与空白对照组比较均降低,差异有统计学意义(P<0.01);模型对照组大鼠血清E2水平第4w、6w、8w与第1w比较均升高,差异有统计学意义(P<0.01)。与模型对照组比较,加减益经汤高、中剂量组与补佳乐组大鼠血清E2在造模后第1w开始明显升高,持续升高至第8w,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);加减益经汤低剂量组大鼠血清E2在造模后第4w明显升高,持续升高至第6w,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。与空白对照组,加减益经汤高、中剂量组与补佳乐组大鼠血清E2在造模后第4w恢复正常水平(P>0.05)。补佳乐组大鼠血清E2在造模后第1w明显高于其他治疗组,差异有统计学意义(P<0.05 或P<0.01)。6.INHB的变化在造模后第1w、2w、3w、4w、6w、8w,模型对照组的大鼠血清INHB的水平与空白对照组比较均降低,差异有统计学意义(P<0.01);模型对照组大鼠第6w和第8w血清INHB水平与第1w比较均升高,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。与模型对照组比较,加减益经汤高、中剂量组大鼠血清INHB水平在造模后第1w开始升高,持续升高至第8w,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);补佳乐组与加减益经汤低剂量组大鼠血清INHB水平在造模后第4w明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与空白对照组比较,加减益经汤高、中剂量组大鼠的血清INHB水平在第8w恢复正常水平(P>0.05)。加减益经汤高剂量组从第6w始与补佳乐组血清INHB比较明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。7.ACTA的变化在造模后第1w、2w、3w、4w、6w、8w,模型对照组的大鼠血清ACTA的水平与空白对照组比较均升高,差异有统计学意义(P<0.01)。与模型对照组比较,加减益经汤高、中剂量组大鼠血清ACTA在造模后第3w开始明显降低(P<0.01);与空白对照组比较,加减益经汤高、中剂量组大鼠血清ACTA在造模后第4w恢复至正常水平(P>0.05),补佳乐组大鼠血清ACTA在造模后第8w恢复至正常水平(P>0.05)。8.FS的变化在造模后第1w、2w、3w、4w、6w,模型对照组的大鼠血清FS的水平与空白对照组比较均降低,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);模型对照组大鼠从第2w起FS水平与第1w比较均升高,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。与模型对照组比较,加减益经汤高、中剂量组大鼠血清FS水平在造模后第2w开始升高,持续升高至第6w,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);补佳乐组在造模后第2w升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与空白对照组比较,加减益经汤高剂量组在第2w周恢复正常(P>0.05);加减益经汤中、低剂量组及补佳乐大鼠的血清FS水平在第3w恢复正常水平(P>0.05)。加减益经汤高剂量组与其它各治疗组比较,在第2w、4w、6w明显升高,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。9.AMH的变化在造模后第1w、2w、3w、4w、6w、8w,模型对照组的大鼠血清AMH的水平与空白对照组比较均降低,差异有统计学意义(P<0.01);模型对照组大鼠从第2w起AMH水平与第1w比较升高,持续升高至第8w,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。与模型对照组比较,加减益经汤高、中剂量组、补佳乐组大鼠血清AMH水平在造模后第1w开始升高,持续升高至第8w,差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05);加减益经汤低剂量组大鼠血清AMH水平在造模后第3w明显升高,持续升高至第8w,差异有统计学意义(P<0.05)。与空白对照组比较,加减益经汤高剂量组在第8w恢复正常(P>0.05)。在造模后第1w、2w、3w、4w、6w、8w,模型对照组大鼠卵巢组织中AMH的IOD与空白对照组比较明显降低,差异有统计学意义(P<0.01);模型对照组大鼠卵巢组织中AMH的IOD第4w、6w、8w与第1w比较均升高,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01),从第4w开始明显升高,持续升高至第8w,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。与模型对照组比较,加减益经汤高、中剂量组大鼠卵巢组织中AMH的IOD在造模后第1w开始明显升高,持续升高至第8w,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);补佳乐组与加减益经汤低剂量组大鼠卵巢组织中AMH的IOD在造模后第2w明显升高,补佳乐组持续升高至第8w(P<0.01),加减益经汤低剂量组持续升高至第4w(P<0.05或 P<0.01)。与空白对照组比较,补佳乐组、加减益经汤高和中剂量组大鼠卵巢组织中AMH的IOD在造模后第6w恢复正常水平(P>0.05)。加减益经汤高、中剂量组大鼠卵巢组织中AMH的IOD在造模后第2w高于加减益经汤低剂量组,差异有统计学意义(P<0.05);加减益经汤中剂量组大鼠卵巢组织中AMH的IOD在造模后第3w与补佳乐组比较明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。10.Bcl-2的变化在造模后第1w、2w、3w、4w、6w、8w,模型对照组大鼠卵巢组织Bcl-2的IOD水平较空白对照组明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)。模型对照组Bcl-2组内各w比较差异有统计学意义(P<0.01),模型对照组从第6w开始明显升高(P<0.01),持续升高至第8w(P<0.01)。与模型对照组比较,加减益经汤高剂量组大鼠卵巢组织Bcl-2的IOD水平从第2w始明显增高,持续升高至第8w,差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05);加减益经汤中、低剂量组大鼠卵巢组织Bcl-2的IOD水平从第3w始明显增高,持续升高至第6w,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。与空白对照组比较,加减益经汤各剂量组大鼠卵巢组织Bcl-2的IOD水平均在第6w恢复至正常水平(P>0.05),补佳乐组在第8w恢复至正常水平(P>0.05)。加减益经汤高组从第3w始与补佳乐组比较明显升高,持续升高至第6w,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01),在第3w、4w与加减益经汤低剂量比较升高,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);加减益经汤中剂量在第3w与补佳乐、加减益经汤低剂量组比较升高,差异有统计学意义(P<0.01)。11.Bax的变化在造模后第1w、2w、3w、4w、6w、8w,模型对照组大鼠卵巢组织Bax的IOD水平较空白对照组明显升高,差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05);模型对照组Bax的IOD水平组内各w比较差异有统计学意义(P<0.01),模型对照组大鼠卵巢组织Bax的IOD水平从第3w开始明显下降,持续下降至第8w,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。与模型对照组比较,补佳乐组、加减益经汤高大鼠卵巢组织Bax的IOD从第3w始明显下降,持续降低至第8w,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);加减益经汤中剂量组大鼠卵巢组织Bax的IOD从第4w始明显下降,持续降低至第8w,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);加减益经汤低剂量组大鼠卵巢组织Bax的IOD第8w始明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。与空白对照组比较,补佳乐组、加减益经汤高剂量组大鼠卵巢组织Bax的IOD水平均在第6w恢复至正常水平(P>0.05);加减益经汤中、低剂量组大鼠卵巢组织Bax的IOD水平均在第8w恢复至正常水平(P>0.05)。在造模后第6w,加减益经汤低剂量组Bax的IOD与补佳乐组、加减益经汤高剂量组比较升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1.复制75mg/kg CTX单次腹腔注射雌性大鼠制造DOR大鼠模型是成功的。加减益经汤和补佳乐均可以改善CTX所致DOR模型大鼠的卵巢功能,且加减益经汤对大鼠卵巢功能的改善呈现出一定的量效关系,即加减益经汤高、中剂量组优于低剂量组。2.CTX模后的大鼠的INHB-ACTA-FS系统及卵巢组织上调控细胞凋亡的因子Bcl-2/Bax的表达都出现了不同程度的失调,即出现INHB、FS水平及Bcl-2的表达下降,ACTA水平和Bax的表达升高,结合前期的研究结果推测CTX导致原始卵泡过度激活,而成熟卵泡却减少的原因可能与CTX导致INHB-ACTA-FS系统的旁/自分泌功能下降,促进PTEN/PI3K及Tsc1/mTORC1信号通路介导的颗粒细胞凋亡有关。3.通过改善INHB-ACTA-FS系统的自/旁分泌功能,进而抑制PTEN/PI3K及Tsc1/mTORC1信号通路介导的颗粒细胞凋亡,从而增加原始卵泡、成熟卵泡,减少卵泡的闭锁,可能是加减益经汤改善DOR卵巢功能的机制之一。这一治疗DOR的机制为临床上加减益经汤治疗DOR提供又一理论依据。