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随着生物技术特别是以基因重组技术为主的基因工程技术的发展,农作物的转基因技术也进入了快速发展的时期。转基因农作物在抗虫、增产、抗除草剂、抗逆等方面的优势已经逐渐显现出来。但转基因农作物可能产生的食品安全性和环境安全性问题也随之产生。外源基因特别是标记基因的安全性问题一直是科研人员研究转基因技术的重点部分。经过科研人员的研究和探索,已经在诸多农作物上采用不同方法实现了无毒性选择标记基因的应用推广和外源基因特别是选择标记基因的删除,以此来提高转基因农作物安全性。其中,筛选标记基因的删除主要有转座子介导的标记基因删除、共转化法删除选择标记基因、位点特异性重组系统介导的选择标记基因删除等主要技术手段。除了选择标记基因的删除,外源基因删除技术是另外一种提高转基因农作物安全性的方法,这项技术主要是通过位点特异性重组系统实现的,关键环节是重组酶的组织特异表达使重组位点之间的外源基因删除。本文主要论述的就是水稻组织特异性表达启动子的筛选和重组位点的拷贝数对重组效率的影响。通过在基因表达数据库中筛选水稻种子特异表达的基因,将基因起始密码子上游约2kb的序列默认为该基因的启动子区,并将该区域克隆,与cin H基因相连并构建到双元载体中,通过农杆菌介导将载体转化水稻愈伤组织并获得再生植株,通过PCR检测确定为转基因植株后,分别提取转基因水稻叶片和种子的总RNA,并反转录为c DNA,并通过RT-PCR检测cin H基因在水稻种子和叶片中的表达量,最终确定载体p ZH053、p ZH058、p ZH059中的备选启动子为种子特异表达启动子,它们分别是基因编号为LOC_Os07g11510、LOC_Os02g15090、LOC_Os07g11650的基因的启动子。通过体外重组实验,验证单拷贝重组位点和多拷贝重组位点的重组效率的差别。所验证的重组系统是Cin H/RS2和Par A/MRS这两个解离酶系统,它们只能催化分子内的重组反应而不能催化不同分子间的重组反应,因而更适宜用外源基因或选择标记基因的删除。通过重组反应、重组反应产物的回收、重组反应产物的限制性内切酶酶切以及琼脂糖凝胶电泳等步骤,验证了不同环形质粒的重组效率,结果发现,Cin H和Par A重组酶体外催化环形质粒中的单拷贝重组位点的重组效率都明显高于多拷贝重组位点的重组效率。并且,环形质粒经过限制性内切酶酶切后形成线性DNA后,Cin H和Par A就无法在体外催化线性DNA分子内的重组反应,说明重组酶Cin H和Par A催化重组反应时,需要DNA分子形成特殊的高级结构,单纯的线性双螺旋结构无法满足重组酶Cin H和Par A催化重组反应的条件。