土贝母苷乙对肝癌Hep G2和宫颈癌HeLa细胞的增殖抑制及机制研究

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目的:土贝母苷乙(tubeimosideⅡ,TBM-II)是从天然产物土贝母中提取出来的主要成分之一,目前已有研究表明土贝母苷乙具有抗肿瘤作用,但关于土贝母苷乙对人源肝癌Hep G2细胞的机制研究及人子宫颈癌HeLa细胞的相关研究未见报道,因此,本研究主要探讨其对肝癌Hep G2细胞及宫颈癌HeLa细胞增殖是否具有抑制作用,并在此基础上阐明土贝母苷乙抗肝癌和宫颈癌可能的相关机制。方法:首先对细胞的活性进行检测,使用CCK-8法检测土贝母苷乙对Hep G2、HeLa细胞的增殖抑制作用,Hoechst 33258染色观察细胞凋亡形态的变化,用DCFHDA荧光染料检测细胞活性氧(ROS)水平,以及用划痕法检测土贝母苷乙细胞迁移能力的影响;然后对土贝母苷乙作用细胞的相关机制进行研究,用Western blotting法检测土贝母苷乙对细胞中与迁移相关的蛋白MMP-2和MMP-14和凋亡相关的蛋白Bcl-2、Bax、细胞色素c(Cyt-c)、Caspase-3、Caspase-9表达水平的影响,用流式细胞仪分析细胞周期、线粒体膜电位以及细胞凋亡;最后利用转录组学检测经15μg/m L土贝母苷乙处理的HeLa细胞,将得到的数据进行生信分析,再利用RT-qPCR检测相关基因表达水平。结果:CCK-8结果显示,用浓度为0,1.25,2.5,5,10,20μg/m L土贝母苷乙处理Hep G2细胞24、48和72 h的IC50值分别为5.735μg/m L、3.852μg/m L和2.472μg/m L,用0,5,10,15,20,25μg/m L土贝母苷乙处理HeLa细胞24、48和72 h的IC50值分别为15.925μg/m L、12.647μg/m L和10.789μg/m L,说明细胞的增殖受到抑制且呈剂量和时间依懒性;用Hoechst 33258染色观察细胞形态时,在显微镜下观察到随着药物浓度的增加细胞数量减少、体积变小、细胞核出现浓染和荧光碎片等典型的凋亡特征;ROS的检测结果发现,随着药物浓度的增加,细胞内ROS水平也在增加;划痕实验结果表明,与对照组相比,随着作用时间和药物浓度的增加,细胞间划痕的愈合率显著下降;Western blotting实验表明,土贝母苷乙上调促凋亡蛋白Bax、caspase-3、caspase-9及胞质Cyt-c的表达,下调抗凋亡蛋白Bcl-2、线粒体Cyt-c及MMP-2、MMP-14蛋白的表达;流式细胞仪分析结果表明,土贝母苷乙能将细胞呈时间和剂量依赖性的阻滞在G2/M期,能使膜电位逐渐下降,并显著增加早期凋亡的细胞比例;对利用转录组学检测的HeLa细胞数据结果进行生信分析发现,共有2039个差异表达的基因(DGEs),其中有1471个DGEs上调,有568个DGEs下调,从KEGG pathway富集分析中选取与凋亡(JUN、GADD45A、ACTG1、BIRC5)、周期(GADD45A、CDC20、CDKN1A、CCNB1)、线粒体(JUN、BNIP3)以及癌症(JUN、GADD45A、BIRC5、KITLG)通路相关的基因进行RT-qPCR验证,其中JUN、GADD45A、BNIP3、CDKN1A表达上调,ACTG1、BIRC5、KITLG、CDC20、CCNB1表达下调,得到的结果与RNASeq结果一致。结论:首先我们在实验结果中发现土贝母苷乙能明显抑制肝癌和宫颈癌细胞的增殖活性,然后通过荧光染色、ROS检测以及划痕实验等现象观察到,土贝母苷乙可能诱导癌细胞发生凋亡;然后通过下调与迁移相关蛋白的表达,说明土贝母苷乙可通过抑制迁移来达到抗肿瘤的作用,以及上调促凋亡蛋白Bax、caspase-3、caspase-9及胞质Cyt-c的表达,下调抗凋亡蛋白Bcl-2、线粒体Cyt-c的表达,使细胞周期阻滞在G2/M期、降低线粒体膜电位、增加细胞早期凋亡比例,说明土贝母苷乙能通过凋亡及线粒体相关通路达到促进凋亡的作用;最后通过转录组学更进一步证明土贝母苷乙可能通过凋亡、线粒体、周期以及癌症相关通路达到抗肿瘤的作用,其中基因JUN、GADD45A、BNIP3、CDKN1A分别在凋亡、癌症(growth arrest and DNA damage inducible alpha),线粒体、细胞周期相关通路中表达上调,ACTG1、BIRC5、KITLG、CDC20、CCNB1分别在凋亡、癌症(baculoviral IAP repeat containing 5、KIT ligand)、细胞周期相关通路中表达下调。本研究为土贝母苷乙的抗癌作用奠定了基础,也为肝癌和宫颈癌治疗及预后方面的研究提供了新思路。
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