【摘 要】
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猪流行性腹泻是一种由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的急性肠道传染病,主要引起一周龄内新生仔猪呈水样腹泻,伴随有呕吐,萎靡,食欲减退,常引发严重脱水而死亡,对畜牧业造成极大
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猪流行性腹泻是一种由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的急性肠道传染病,主要引起一周龄内新生仔猪呈水样腹泻,伴随有呕吐,萎靡,食欲减退,常引发严重脱水而死亡,对畜牧业造成极大的损失。小肠的炎症反应是PEDV感染引起仔猪腹泻、脱水的主要原因,该反应主要通过激活NF-κB信号通路产生炎性细胞因子发挥作用。而NF-κB信号通路的调控既包括蛋白水平的信号分子表达量和翻译后修饰调控,也包括转录水平的mi RNA、lnc RNA等的表达和作用,但lnc RNA是否参与PEDV感染过程中炎症的调控尚未得知。本研究利用二代转录组测序技术,分析PEDV感染猪小肠以及Vero细胞样品中lnc RNA的表达水平,重点筛选与NF-κB通路相关并差异表达的lnc RNA,荧光定量PCR验证其表达规律,构建lnc RNA过表达载体,在Vero细胞中进行真核表达,分析过表达lnc RNA后PEDV复制水平的变化,初步分析lnc RNA在PEDV感染过程的影响机制,为猪流行性腹泻的致病机理研究提供一定基础。1、PEDV感染猪小肠样品以及Vero细胞样品的转录组分析本研究通过PEDV-YJH分别感染猪小肠组织以及Vero细胞,采集样品送生物公司进行转录组测序。PEDV感染Vero细胞的转录组结果表明:相比MOCK组,PEDV感染0 h时,lnc RNA有70条上调、31条下调;24 h时,lnc RNA有40条上调、54条下调;48 h时,lnc RNA有34条上调、43条下调。PEDV感染猪小肠样品转录组结果表明:m RNA差异表达谱中,相比MOCK组,PEDV感染组有167个基因上调以及169个基因下调,lnc RNA表达谱中有47条上调和62条下调。筛选出与NF-κB通路相关的差异表达lnc RNA 19条,荧光定量PCR进行验证,lnc RNA 2694.1、lnc RNA 3977.1在PEDV感染Vero细胞48h表达水平显著上升,lnc RNA 18325在PEDV感染Vero细胞24 h时表达水平显著上升,但在48h时明显受到抑制。靶向SUDS3的lnc RNA 11810.9在PEDV感染Vero细胞和小肠组织均有差异性表达,且呈表达显著上升。2、NF-κB相关的差异表达lnc RNA及SUDS3影响PEDV复制水平的研究为了进一步探究lnc RNA是否对PEDV的复制水平具有调节作用,本研究表构建lnc RNA 2694.1、lnc RNA 3977.1、lnc RNA 18325及SUDS3达载体,在Vero细胞中进行真核表达,并接种0.6 MOI的PEDV,荧光定量PCR检测三种lnc RNA及SUDS3的表达,同时检测上清中PEDV病毒核酸含量,结果显示:lnc RNA2694.1、lnc RNA 3977.1、lnc RNA 18325及SUDS3的表达水平显著上升,但是经PEDV感染后,三种lnc RNA及SUDS3的表达水平都受到不同程度的抑制;CPE观察结果表明经PEDV感染后,相比未感染病毒组,CPE出现时间更早且病变更明显;各组细胞上清中病毒拷贝数明显多于未过表达三种lnc RNA及SUDS3组。以上结果表明,NF-κB相关的lnc RNA 2694.1、lnc RNA 3977.1、lnc RNA 18325及SUDS3参与了调控PEDV复制水平,为进一步探索PEDV复制引起的炎症反应机制奠定了良好基础。
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