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目的:本课题选取人慢性粒细胞白血病细胞系K562及其耐药细胞系K562/A02和K562/G01为研究模型,探讨PI3K抑制剂ZSTK474联合酪氨酸激酶抑制剂Imatinib在慢性粒细胞白血病中的抗白血病作用和分子机制,为白血病的治疗提供新的研究思路,也为ZSTK474应用于抗白血病研究提供实验依据。方法:1.Chou-Talalay法结合Calcu Syn软件分析K562、K562/A02、K562/G01细胞中ZSTK474联合Imatinb的联合效应,确定最佳联合用药比例;2.利用MTT、软琼脂克隆实验检测ZSTK474联合Imatinb对K562、K562/A02、K562/G01及PBMCs细胞活力及增殖的影响;3.通过流式细胞术检测ZSTK474联合Imatinb对K562、K562/A02、K562/G01细胞周期和凋亡的影响;4.通过MDC和m-RFP-GFP-LC3自噬流镜下观察ZSTK474联合Imatinb对K562、K562/A02、K562/G01细胞自噬的影响;5.利用MTT法检测ZSTK474联合Imatinb对K562/A02、K562/G01的化疗增敏活性;采用流式细胞术检测联合用药对多药耐药蛋白泵药活性的影响;6.利用q RT-PCR实验研究ZSTK474联合Imatinb对细胞周期、自噬、凋亡、耐药相关蛋白m RNA表达水平的影响;7.Western-blot法检测ZSTK474联合Imatinb对K562、K562/A02、K562/G01细胞周期G0/G1期相关蛋白(cyclin D1、p27、p-p Rb)、凋亡相关蛋白(caspase9、caspase3、PARP裂解片段)、自噬相关蛋白(p62、LC3B)、耐药相关蛋白(P-gp、MRP1)表达水平或磷酸化水平的影响,以及BCR-ABL/PI3K/Akt通路及下游分子表达水平及磷酸化水平的影响;结果:1.在K562、K562/A02、K562/G01细胞中筛选了IC 25 ZSTK474?IC50 Imatinib,IC 50 ZSTK474?IC 50 Imatinib,IC 50 ZSTK474?IC 25 Imatinib三个联合比例浓度,结果发现K562中的IC 50 ZSTK474?IC 50 Imatinib、K562/A02中的IC 50ZSTK474?IC 50 Imatinib、K562/G01中的IC 25 ZSTK474?IC 50 Imatinib的联合用药比例协同效果最好,因此选择以上联合比例浓度进一步开展药物协同机制研究。2.MTT结果表明ZSTK474联合Imatinb能够抑制K562、K562/A02、K562/G01细胞增殖,且药物联用的增殖抑制活性显著大于药物单用,此外实验选取的三组ZSTK474与Imatinb联合用药比例均对PBMC细胞表现出较低的细胞毒性。软琼脂克隆实验显示ZSTK474联合Imatinb对K562、K562/A02、K562/G01表现出更显著地增殖抑制作用。3.流式细胞术结果显示,K562、K562/A02、K562/G01细胞中ZSTK474联合Imatinb能阻滞细胞周期G0/G1期、诱导细胞发生凋亡,且联合用药组的周期阻滞作用和诱导凋亡作用显著大于药物单用组;Western blot结果显示,联合用药能上调周期相关蛋白p27的表达水平,下调cyclin D1、p-p Rb的水平,促进凋亡相关蛋白caspase9、caspase3、PARP发生裂解。4.MDC和m-RFP-GFP-LC3自噬流实验发现ZSTK474联合Imatinb能够诱导K562、K562/A02、K562/G01细胞发生自噬,且联合用药的诱导自噬活性大于药物单用组;Western blot结果显示,联合给药使自噬蛋白LC3BII/LC3BI表达显著升高,p62的表达显著降低。5.Western-blot检测可能的信号传导通路,结果显示ZSTK474与IM联合用药能下调K562、K562/A02、K562/G01细胞中Bcr-Abl、PDK1、Akt、m TOR、G3K-3β磷酸化水平,表明联合用药可能是通过抑制BCR-ABL/PI3K/Akt通路发挥抗CML作用。6.q RT-PCR结果显示ZSTK474与IM联合用药能够下调K562、K562/A02、K562/G01细胞p62、Bcl-2的m RNA水平,上调p27、Bax的m RNA水平,且联合用药优于药物单用。7.MTT检测K562/A02和K562/G01细胞化疗增敏结果显示ZSTK474联合Imatinb能够增强K562/A02细胞对ADR的敏感性,但对K562/G01细胞增敏较弱。底物蓄积实验显示联合用药引起耐药细胞中Rh123、5-CFDA的蓄积;此外,联合用药抑制了耐药细胞中MDR1、MRP1的表达。结论:1.ZSTK474联合Imatinb在IC50 ZSTK474?IC50 Imatinib(K562细胞)、IC50ZSTK474?IC50 Imatinib(K562/A02细胞)、IC25ZSTK474?IC50 Imatinib(K562/G01细胞)的比例下显示出较强的药物协同作用。2.ZSTK474联合Imatinib对K562、K562/A02、K562/G01细胞具有抑制增殖、阻滞周期G0/G1期、诱导凋亡和自噬的活性,且药物联合优于药物单用;ZSTK474联合Imatinib抗CML的分子机制可能是协同抑制BCR-ABL/PI3K/Akt通路。3.ZSTK474联合Imatinb可能是通过降低K562/A02、K562/G01细胞中多药耐药蛋白MDR1、MRP1的表达水平和泵药活性发挥增敏作用。