英国红芸豆抗氧化肽对H2O2诱导PC12细胞氧化应激损伤的保护作用

来源 :黑龙江八一农垦大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:ig226
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近年来,与氧化损伤有关的慢性疾病已经严重影响到人类健康,当机体受到外界刺激时,体内活性氧(ROS)增加,导致氧化还原系统失衡,进而积累过多的ROS,而过多ROS会损伤细胞、组织以及系统等,进而造成一系列疾病。合理使用抗氧化剂可以抑制或减缓氧化的发生,但由于合成抗氧化剂具有较大的毒性,所以天然抗氧化剂因其毒副作用小且抗氧化能力强而受到越来越多人的关注,其中抗氧化肽是新型的天然抗氧化剂。抗氧化肽因具有较强的抗氧化活性和很高的生物安全性而成为国内外的研究热点。本文以英国红芸豆为原料,首先,利用碱性蛋白酶酶解制备英国红芸豆抗氧化肽,然后采用超滤分离方法将抗氧化肽进行分级,研究其不同肽段体外抗氧化活性,并且利用葡聚糖凝胶G-15层析对较高抗氧化活性的超滤组分再次进行分离纯化,最后将其作用于PC12细胞,用细胞模型探究英国红芸豆抗氧化肽对H2O2诱导PC12细胞氧化应激损伤的保护作用以及对抗氧化作用机制进行了探讨,以期为英国红芸豆抗氧化肽在食品保健及医药领域的应用提供理论依据,主要研究内容及结果如下:(1)首先,通过碱提酸沉的方法提取英国红芸豆蛋白质,再利用碱性蛋白酶水解蛋白质制备英国红芸豆抗氧化肽,用超滤法将其抗氧化肽分级,分级组分分别为:小于1 k D、1 k D-3 k D、3 k D-5 k D、大于5 k D。其次,分析各个超滤组分的体外抗氧化活性。研究结果表明:小于1 k D的英国红芸豆抗氧化肽抗氧化能力最强,羟自由基清除率为49.26%、DPPH自由基清除率为27.46%、还原力为0.501。最后,利用葡聚糖凝胶G-15层析分离纯化小于1 k D的英国红芸豆抗氧化肽,分离纯化出2个组分为BRKBAPC-1、BRKBAPC-2,峰面积分别为932.65、1440.33。(2)在前期材料制备、纯化以及体外抗氧化活性测定的基础上,首先,建立过氧化氢(H2O2)细胞氧化损伤模型。PC12细胞经125、250、500、1 000、2 000、4 000μmol/L的H2O2作用4 h后,细胞存活率分别降至77.81%、54.33%、13.83%、5.13%、1.94%以及1.77%,因此,在后续的试验中,选择250μmol/L的H2O2作为损伤模型浓度;其次通过细胞存活率确定了抗氧化肽低、中、高剂量作用浓度梯度为50、100、200μg/m L,并发现组分BRKBAPC-2相比BRKBAPC-1具有较强的保护作用和促生长作用。因此,选用BRKBAPC-2组分进一步研究抗氧化肽组分对H2O2诱导PC12细胞氧化应激损伤的保护作用。(3)以BRKBAPC-2组分为研究对象,探究对H2O2诱导PC12细胞氧化应激损伤的保护作用及其机制。结果表明:抗氧化肽组分BRKBAPC-2能缓解H2O2对PC12细胞造成的细胞生长抑制作用,减少胞内活性氧(ROS)水平,维持细胞形态,降低胞内丙二醛(MDA)含量及胞外乳酸脱氢酶(LDH)活力,提高胞内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)的酶活力以及胞内还原型谷胱甘肽(GSH)含量,并且抑制线粒体膜电位(MMP)的降低、改善细胞周期的阻滞情况、阻止细胞凋亡关键酶Caspase-3和Caspase-9的激活。综上所述,通过BRKBAPC-2组分预处理24 h后,可改善250μmol/L的H2O2诱导PC12细胞氧化应激损伤的情况,可见,抗氧化肽组分BRKBAPC-2对细胞的氧化损伤具有一定的保护作用。
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