水果采后病原真菌给采后造成很大损失,且病原菌已开始对常用的唑类和多稀类杀菌剂产生抗药性,因此,新型杀菌剂的研发对于水果产业的可持续发展非常重要。鞘脂不仅是构成细胞质膜的重要组份,而且还作为信号分子参与多种生命活动的调控。在病源真菌中,已证明鞘脂在菌丝形成、孢子萌发和致病性方面起着重要的作用,且其鞘脂合成相关酶的结构与动物中同源物显著不同,因此,真菌鞘脂代谢途径已成为动物中新型抗病原真菌药剂筛选的候选靶标位点。本研究拟以重要的水果采后病原真菌--胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides,C.g）为材料,基于已测序的基因组序列,分离克隆该菌中鞘脂合成关键基因--葡糖基神经酰胺合成酶（glucosylceramide synthase,GCS）基因,通过对GCS基因的敲除与互补,明确此基因的缺失对胶孢炭疽菌生长、附着孢形成、产孢和致病性的影响,并进一步分析了外源GCS ds RNA对炭疽菌致病性的影响。望能明确胶胞炭疽菌GCS基因的具体功能。为进一步病原菌的防控提供理论支持。及具体结果如下:1、缺失突变体与回补突变体的获得通过Gateway基因同源重组技术,用潮霉素B（Hyg B）抗性基因片段取代C.g基因组中GCS基因ORF,获得基因缺失突变体6个,命名为ΔCg GCS1,ΔCg GCS7,ΔCg GCS10,ΔCg GCS11,ΔCg GCS14,ΔCg GCS22,并用PCR方法初步验证了基因组中的正确替换。各基因缺失突变体表现对Hyg B的抗性,且能稳定遗传。用类似的方法,以ΔCg GCS1为材料,将GCS基因的基因组序列（包括启动子和终止子部分）整合进突变体,以腐草霉素（Phleomycin）抗性为筛选标记基因,获得基因回补体5个,命名为ΔCPCg GCS1,ΔCPCg GCS2,ΔCPCg GCS3,ΔCPCg GCS4,ΔCPCg GCS5。定量PCR检测显示,突变体中几乎检测不到GCS基因的表达,回补突变体中GCS基因的表达呈现出与野生型相当的水平。这为进一步研究Cg GCS基因的功能提供了很好的突变体材料。2、GCS基因突变体对病原菌菌丝生长、孢子萌发、附着胞形成、产孢能力及致病性的影响同野生型相比,突变体的菌丝生长速率明显下降,菌丝成扭曲状且分支增多;孢子萌发率和附着胞形成率较野生型相比也显著降低。而且,在正常的培养条件下,突变体几乎不产孢。此外,与野生型菌株相比,ΔCg GCS突变体在番茄和芒果果实上的侵染速度明显减慢,致病性下降一半以上。而回补突变体菌株各方面的表型与野生型菌株一致。以上结果表明Cg GCS基因在病原菌的菌丝生长、孢子萌发、附着胞形成、产孢以及致病性中起着重要的作用。3、Cg GCS基因突变对真菌鞘脂合成的影响通过HPLC-MS/MS液质联用仪对病原菌中的鞘脂物质进行了分析,结果发现,Cg GCS的缺失导致鞘脂物质发生了明显的变化。相比于野生型菌株,缺失突变体中总的LCB和g Cer含量显著下降,总的h Cer含量上升,分别是野生型菌株的0.26倍、0.03倍和4倍。具体而言,虽然总的LCB的含量是下降的,但在检测出的5种LCB中d18:0含量上升。GCS上游底物h Cer含量均上升,尤其是检测d19:2 h18:0和d18:2 h18:0的含量上升分别约达11.6倍和5.25倍。对于g Cer而言,5种检测出的g Cer含量均急剧下降,尤其是d19:2 g18:0和d19:2 g18:1,分别只有野生型菌株含量的0.2719%和5.48726%。以上结果一方面说明了我们所鉴定的GCS基因是真正的葡糖基神经酰胺合成酶基因,另一方面说明GCS基因缺失明显的影响病原菌鞘脂代谢过程。4、突变体与野生型转录组的对比分析转录组分析结果表明,相对于野生型,突变体有264个基因上调,317个基因下调。GO分析显示差异表达基因主要参与代谢相关的生物过程,其表达产物主要分布于膜相关的部分中主要起催化和结合相关的活性。KEGO分析表明差异表达基因主要集中在代谢相关的生物途径。进一步分析显示胶胞炭疽菌重要致病因子果胶裂解酶（pectate lyase）基因的表达在突变体中显著下降,说明葡萄糖基神经酰胺能通过影响病原菌致病基因的表达来调控其致病性。5、体外接种Cg GCS基因ds RNA对胶胞炭疽菌致病性的影响通过体外转录合成Cg GCS基因片段的ds RNA,然后将ds RNA先于病原菌接种于番茄果实,发现Cg GCS基因片段的ds RNA能明显减缓病原菌的侵染,致病性下降一半以上。