目的:疟疾是严重危害人类健康的全球三大公共卫生问题之一,其中由恶性疟原虫引起的恶性疟最为危险致命。目前疟疾的预防和治疗主要依靠抗疟药,然而恶性疟原虫已经普遍对传统的抗疟药产生抗性。因此,疟疾抗药性监测和相关分子研究在全球疟疾消除进程中非常重要。研究湖北省武汉市输入性恶性疟原虫相关耐药基因pfnhe1、pfcrt、pfmdr1、pfk13的多态性,确定耐药相关的分子标记。初步建立q PCR、AS-PCR及AS-LAMP检测恶性疟原虫耐药基因SNP方法,并将建立的检测方法进行初步临床应用。方法:收集湖北省武汉市2011-2016年自非洲和东南亚返乡确诊为恶性疟患者的干滤纸血斑,共211份。提取DNA,应用巢式PCR分别扩增pfnhe1、pfcrt、pfmdr1、pfk13基因中具有多态性的片段,对扩增产物进行测序,分析基因的突变情况以及pfnhe1、pfcrt和pfmdr1的单倍型。根据耐药基因pfcrt 72-76位和pfmdr1 86、184位的突变情况,构建野生型和突变型重组质粒,并通过测序验证。设计探针和引物,优化q PCR、AS-PCR及AS-LAMP反应体系及反应条件并进行临床样本检测。结果:1.（1）pfnhe1基因:一共观察到28个不同的ms4760亚型。其中,ms4760-1、ms4760-3和ms4760-7是主要流行的三种亚型。此外,新发现了未见报道的5个新的ms4760亚型。（2）pfcrt基因:第72-76位点显示四种单倍型,50.57%为野生型CVMNK,1.14%为突变型SVMNT,25%为突变型CVIET,23.30%为混合型CV M/I N/E K/T。（3）pfmdr1基因:86和184位点为主要突变位点,突变率分别为22.28%,60.01%。（4）pfk13基因:观察到四个位点突变,依次为S550S、R561H、R575R/K、V589I,突变率分别为1.09%、0.54%、0.54%、0.54%。2.q PCR对pfmdr1基因86位点进行基因分型,一共有183个临床样本与前期巢式PCR结合测序的结果一致,检测灵敏度为10~5copies/μL,整个检测过程只需要1小时。设计出用于检测pfmdr1基因86、184位野生型和突变型的AS-PCR引物,以及pfcrt基因突变型SVMNT的AS-LAMP引物,对临床样本的检测结果与巢式PCR结合测序的结果一致。结论:1.湖北省武汉市输入性恶性疟患者的pfnhe1基因ms4760亚型有中度多样性特征。2.湖北省武汉市输入性恶性疟患者的pfcrt和pfmdr1普遍存在与氯喹和阿莫地喹耐药相关的多态性突变,而pfk13存在可能与青蒿素耐药相关的有限突变。3.耐药基因pfcrt、pfmdr1、pfk13可以继续作为分子标记物检测氯喹、阿莫地喹和青蒿素抗性。4.本研究建立的q PCR方法适用于快速对pfmdr1基因86位进行基因分型,AS-PCR对pfmdr1基因86位和184位进行基因分型。