研究背景和目的:狂犬病主要是由狂犬病毒（Rabies virus,RABV）引起的一种人兽共患的乙类传染病,致死率接近100%,其中我国狂犬病死亡率位于亚洲第二,且每年用于防治狂犬病的费用超过100亿元,对社会造成巨大的经济负担。目前预防狂犬病3级暴露以注射人或马抗狂犬病毒免疫球蛋白为主,但前者价格昂贵,后者副反应严重,且两者均不易大量制备。研发特异性针对狂犬病毒的全人源单克隆抗体具有靶向性强、灵敏度高和毒副作用低等优势,目前狂犬单抗药物市场几乎为空白。狂犬病毒糖蛋白（Glycoprotein,GP）是该病毒表面唯一的保护性抗原蛋白。因此,本课题的目的就是利用我们已建立的人记忆性B细胞活化平台快速筛选特异性针对狂犬病毒GP片段的全人源单克隆抗体药物,以期为临床上提供有效的抗狂犬病毒药物。实验方法:1.狂犬病毒抗原蛋白的制备:通过文献和专利等相关资料,确定以CTN-1病毒株的GP为抗原蛋白,在Genbank中获取其基因组序列（序列号:FJ959397.1）,选定前439位氨基酸即包含目前报道的所有抗原位点在内的膜外区片段为抗原蛋白序列,合成目的序列并插入GST标签,在大肠杆菌中表达纯化,然后通过Western bolt和Elisa等方法进行验证。2.RABV特异性记忆B细胞的分离与活化:从多个曾接种过狂犬疫苗的志愿者中筛选出RABV Ig G含量较高的个体,每个个体采取50 ml全血（抗凝）,首先利用磁珠分选试剂盒从血液中分离记忆B细胞,然后体外诱导记忆B细胞活化成浆细胞,最后利用RABV特异性抗原蛋白通过Elisa方法鉴定出分泌特异性抗体的阳性浆细胞。3.抗体基因文库的构建:首先提取活化后阳性孔的浆细胞RNA,并将重链和轻链可变区的序列反转录为c DNA,通过巢式PCR两轮扩增、胶回收和酶切酶连等步骤将抗体重链和轻链基因分别克隆到真核细胞表达载体中,完成抗体重轻链可变区基因文库的构建。4.特异性单克隆抗体的筛选:首先通过细菌转化获得整个文库的质粒混合物,然后将大的重链或轻链混合文库均分成几份,再将某重链小份组和某轻链小份组进行不同组合组装成完整抗体,最后用Elisa筛选,再将阳性结果组分成更小的组份进行筛选,直至筛选到单个抗体克隆,通过这种模式在HEK239T细胞中进行逐级筛选,最后筛选出特异性全人源单克隆抗体。实验结果:1.在大肠杆菌体系中成功制备出抗原蛋白,利用Western blot和Elisa等方法对抗原结合抗体的特异性以及识别抗体的灵敏度进行了验证。结果显示,我们的抗原符合筛选要求,可用于后续的抗体筛选。2.从RABV Ig G阳性志愿者血液中分离出记忆B细胞后,在体外成功活化成可分泌抗体的浆细胞,并筛选出所需阳性浆细胞。3.成功构建了抗体重轻链可变区的基因文库,并利用我们独创的方法筛选到5株针特异性针对狂犬病毒GP片段的单克隆抗体。结论:1.我们成功构建了狂犬病毒特异性抗原蛋白的原核表达载体,并利用大肠杆菌原核系统对其进行了表达和纯化,该抗原蛋白已成功用于抗体的筛选。2.我们已利用我们的筛选平台成功地筛选到了5株针对狂犬病毒GP片段的特异性全人源单克隆抗体序列,为临床上开发治疗狂犬病的抗体药物奠定了基础。