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研究背景:妊娠期糖尿病(Gestational diabetes mellitus,GDM)是妊娠前糖代谢正常/出现潜在糖耐量减退的状况但是妊娠期才出现/确诊的糖尿病,并且近年来发病率一直呈上升趋势。作为最常见的妊娠并发症之一,GDM影响全球近17%的妊娠妇女。在中国,随着中国人饮食标准的不断升高,约有290万孕妇患有这种疾病。GDM对母亲和后代都有长期或者短期的不良结局影响。因此在妊娠早期确定其可改变的危险因素能有助于GDM的早期预防与控制。GDM是一种极为复杂的情况,它主要包括高胰岛素抵抗率和慢性低级别炎症反应。鉴于孕期生理性高脂血症及高脂饮食导致肠道微生物分布改变,LPS产生增多,进而导致胰岛素外周靶器官炎症因子表达增加,异常活化的炎性因子引起高表达的CEBPβ-HDAC1复合物,细胞内NAD+表达降低,抑制SIRT1启动子水平,最终导致孕期胰岛素敏感性降低等研究基础与最新聚焦。本研究旨在探索高脂血症及高脂饮食模式协同导致外周循环中LPS产生增加,进而胰岛素外周靶器官炎性因子表达上调以及ROS堆积,CEBPβ-HDAC1复合物合成增多,细胞内NAD+合成异常,抑制SIRT1启动子水平,最终引起孕期胰岛素敏感性下降后胰岛素抵抗发生。目的:GDM的发病机制与产妇及胎儿的不良结局息息相关,胰岛素靶器官是发生胰岛素抵抗的重要场所。本研究旨在探讨LPS通过HDAC1调控SIRT1对胰岛素靶器官的影响,从而揭示炎性因子和胰岛素功能在GDM中的作用及意义,为探索GDM相关的发病机制提供新的观点与科学依据。方法:(1)采集正常孕妇与GDM患者的外周血分离血清样本,采用ELISA kit检验血清中LPS,TC以及TG浓度水平。对孕妇血清和脂肪组织进行定量脂肪酸浓度测量通过气相色谱-氢火焰离子化检测器(Gas Chromatography-Flame Ionization Detector,GC-FID)来采集结果。收集正常孕妇与GDM患者的大网膜和腹直肌组织,利用Western blotting来检测炎性因子TNF-α,NF-κB,组蛋白去乙酰酶(HDAC1),CAAT/增强子结合蛋白β(CEBPβ),NMNAT-1,SIRT1以及胰岛素信号通路PI3K-AKT的蛋白磷酸化。(2)用低浓度的LPS诱导人正常肝细胞株(L02细胞),研究LPS对肝脏炎性因子环境以及胰岛素抵抗形成的影响及机制。q RT-PCR检测加入LPS后的L02细胞炎性因子IL1,IL6以及TLR-4;Western blotting技术检测到TNF-α,NF-κB,HDAC1和SIRT1相关蛋白以及胰岛素信号通路IRS-1/PI3K/AKT蛋白磷酸化水平;ELISA kit检测细胞葡萄糖和胰岛素,NAD+水平;ROS水平使用活性氧试剂盒进行检测;免疫荧光检测细胞NMNAT-1的表达。(3)L02细胞加入TLR-4阻滞剂TAK-242后观察其是否能恢复LPS诱导后的各通路的表达。q RT-PCR检测加入TAK-242后的L02细胞炎性因子IL-1,IL-6以及TLR-4;Western blotting技术对细胞TNF-α,NF-κB,HDAC1,SIRT1相关蛋白以及胰岛素关键信号分子通路IRS-1/PI3K/AKT蛋白磷酸化表达量进行测量。(4)L02细胞使用慢病毒敲低HDAC1后观察各通路的表达。q RT-PCR检测HDAC1敲降后的L02细胞炎性因子IL-1,IL-6以及TLR-4;Western blotting技术检测到TNF-α,NF-κB,HDAC1,SIRT1相关蛋白,胰岛素信号通路IRS-1/PI3K/AKT蛋白磷酸化水平。(5)将C57BL/6J小鼠分别喂养低脂饮食(LFD)建立对照组,喂养高脂饮食(HFD)建立GDM组模型,对小鼠进行体重的称量,口服糖耐量试验(Oral glucose tolerance test OGTT)及胰岛素水平的检测。在构建成功的GDM组小鼠妊娠的15.5-17.5天,使用3mg/kg TAK-242每天进行GDM组小鼠尾静脉注射。收集小鼠血清并解剖收取肝脏,性腺脂肪和骨骼肌组织样本。Western blotting技术对细胞TNF-α,NF-κB,HDAC1,SIRT1相关蛋白以及胰岛素关键信号分子通路PI3K/AKT蛋白磷酸化表达量进行测量;ELISA kit检测胰岛素,LPS,TC以及TG水平;ROS浓度活由性氧试剂盒检测;三组小鼠肝脏和性腺脂肪结构由苏木精—伊红染色法(Hematoxylin-eosin staining,HE)观察;三组小鼠性腺脂肪中SIRT1的阳性表达由免疫组织化学观察;三组小鼠肝脏和骨骼肌结构由透射电子显微镜(Transmission electron microscope,TEM)观察。结果:(1)LPS浓度在GDM患者血清中的表达高于正常孕妇组。HDAC1和CEBPβ在GDM患者脂肪组织和骨骼肌组织的表达高于正常孕妇,并伴有NMNAT-1和SIRT1表达的下调。GDM患者大网膜组织和腹直肌组织的胰岛素信号通路PI3K/AKT的蛋白磷酸化表达低于正常孕妇,发生胰岛素抵抗。(2)LPS诱导的L02细胞24h后炎性因子水平升高,细胞出现胰岛素信号通路表达下降以及葡萄糖浓度升高。HDAC1和CEBPβ在LPS诱导后的蛋白表达高于对照组细胞,并伴有NMNAT-1和SIRT1蛋白表达的下调,TAK-242加入后能恢复HDAC1,SIRT1相关蛋白的表达水平。LPS诱导后的L02细胞胰岛素信号通路IRS-1/PI3K/AKT的蛋白磷酸化表达低于对照组细胞,TAK-242加入后能恢复胰岛素信号通路IRS-1/PI3K/AKT通路的蛋白磷酸化表达。HDAC1敲降后,出现CEBPβ蛋白表达的下调而NMNAT-1和SIRT1蛋白表达的上调。HDAC1敲降后能恢复胰岛素信号通路IRS-1/PI3K/AKT的蛋白磷酸化表达。(3)HFD诱导的GDM小鼠模型中炎性因子水平升高,胰岛素靶器官(肝脏,脂肪,骨骼肌组织)出现胰岛素信号通路蛋白磷酸化表达下降,血糖以及胰岛素浓度升高,胰岛素抵抗形成。HDAC1和CEBPβ在GDM组小鼠胰岛素靶器官(肝脏,性腺脂肪及骨骼肌组织)蛋白表达高于对照组小鼠,并伴有NMNAT-1和SIRT1蛋白表达的下调,TAK-242加入后能恢复HDAC1,SIRT1相关蛋白的表达水平。GDM组小鼠胰岛素靶器官(肝脏,性腺脂肪及骨骼肌组织)胰岛素信号通路PI3K/AKT蛋白磷酸化表达低于对照组小鼠,TAK-242加入后能恢复肝脏和骨骼肌组织中胰岛素信号通路PI3K/AKT的蛋白磷酸化表达。结论:GDM中LPS的异常增加会影响机体氧化应激,SIRT1表达降低,胰岛素抵抗,导致胰岛素靶器官内炎症因子和氧化应激增加,影响葡萄糖和脂质的代谢能力,导致机体发生胰岛素抵抗,在GDM的发病机制发挥重要的作用。这可能与炎性环境与ROS的堆积介导细胞内HDAC1及CEBPβ表达上调,进而导致NAD+含量下降,SIRT1表达下调,胰岛素信号通路收到抑制有关。