目的：MicroRNAs（miRNAs）是一类片段长度为18-24 nt的非编码蛋白的小分子RNA，在病毒感染、生长发育、炎症、胚胎发育以及癌症发生等过程中发挥重要的作用。研究表明miRNA可通过靶向结合目的基因的mRNA3非编码区从而引起靶基因的降解或者抑制其翻译，在转录后水平调控基因的表达。异常表达的miRNA在多种肿瘤中扮演重要的角色，包括肺癌。肺癌是严重威胁人类健康的一类恶性肿瘤，目前尚缺乏早期、敏感的诊断标志物。近年来有研究表明，在肺癌患者肺组织及血液中存在差异表达的miRNA并可用于区分肺癌患者及正常个体。但是，目前这些研究集中关注的是肺癌形成之后，肺脏miRNA的表达改变，仍然缺乏对于肺癌发生早期的miRNA表达改变相关研究。本研究建立一种环境致癌剂诱导肺癌模型，从肺组织及血液两个方面研究诱癌的不同阶段miRNA的动态改变，为开展肺癌新型的标志物提供新的实验依据。乌拉坦是一种广泛存在于酒精性饮料、面包、奶酪等发酵食品中的致癌物，其诱导的Balb/c小鼠肺癌具有较好的特异性以及具有类似于人类肺腺癌的生物学特征，由乌拉坦诱发的肺癌动物模型为深入开展肺癌相关研究提供了方便。目前能用于检测miRNA的Solexa测序已被广泛应用于小RNA研究领域，具有高通量、高灵敏度、高准确性等优势。本研究用致癌剂乌拉坦诱发Balb/c小鼠肺癌模型，运用Solexa技术进行高通量测序，测序片段的长度经过统计分析并进行Rfam、Genbank数据库比对以及重复序列筛选，最后把所得到的片段进行注释分类，找出已知和未知miRNA，然后进行已知miRNA差异表达分析，构建miRNA差异表达谱；对未知的miRNA进行预测，重点针对特定的miR-1a在乌拉坦致癌的过程组织以及血液中的miRNA进行了动态分析，为肺癌的早期检测生物标志物研究积累重要的实验数据。　　方法：⑴乌拉坦诱发小鼠肺癌模型的建立 Balb/c小鼠为实验动物，乌拉坦处理组小鼠经腹腔注射乌拉坦溶液（1 g/kg，每周1次，连续4周），每次注射前根据小鼠体重临时配制新鲜乌拉坦溶液。之后，小鼠常规饲养于SPF动物房，分别在首次乌拉坦处理小鼠之后第6周、12周、24周剖杀小鼠，对肺组织进行病理学检查，建立乌拉坦诱发小鼠肺癌模型。⑵Balb/c小鼠肺组织小RNA Solexa测序在乌拉坦处理Balb/c小鼠之后第24周，分别取等量小鼠个体肺癌及癌旁组织总RNA混合，制备相应的乌拉坦处理组中癌组织及癌旁组织总RNA样本，送至深圳华大基因公司并进行Solexa小RNA测序。分析Solexa测序获得的肺组织小RNA序列长度特征、公共序列信息，并将干净序列与Genbank、Rfam数据库、内含子、外显子、重复序列等比对之后，再进行小RNA注释，鉴定已知miRNA与目前尚未发现的新miRNA。⑶乌拉坦处理组肺癌及癌旁组织 miRNA差异表达谱分析。依据差异倍数（log2 ratio)>1.0、P<0.01以及在肺癌及癌旁组织中miRNA表达量大于1的标准，当miRNA同时满足上述条件时，可纳入差异表达谱分析。⑷实时荧光定量 PCR内参基因的选取在肺组织中，用定量 PCR检测U6sRNA的表达，分析并统计肺癌及癌旁组织中U6snRNA基因的CT值差异；在乌拉坦处理组血清以及对照组血清中，用定量PCR检测miR-16的表达，分析并统计两组之间miR-16基因CT值的差异。⑸小鼠个体肺组织候选miRNA表达分析基于乌拉坦处理组肺癌及癌旁组织两组之间miRNA差异表达谱，筛选miR-433、miR-127、miR-193、miR-1a、miR-34c作为重点候选miRNAs，运用实时定量RT-PCR方法，在首次乌拉坦处理后的第24周小鼠肺癌及癌旁组织中验证上述五个miRNAs的表达水平。⑹乌拉坦诱发小鼠肺癌过程中不同时间点的肺组织miR-1a表达分析运用Taqman探针法定量PCR方法，以U6snRNA为内参，分析第6周、12周、24周对照组及乌拉坦处理组小鼠肺组织中miR-1a表达变化。⑺肺癌细胞系中miR-1a表达分析运用Taqman探针法定量PCR方法，以U6snRNA为内参，检测人肺癌细胞系A549、H1299、H446细胞中miR-1a的表达水平。⑻乌拉坦诱发小鼠肺癌过程中不同时间点血清 miR-1a表达分析运用Taqman探针法定量PCR方法，以miR-16为内参，分析第6周、12周、24周对照组及乌拉坦处理组小鼠血清中miR-1a表达变化。⑼统计学分析采用SPSS17.0软件统计分析，Paired t test、Student ttest、Mann-Whitney用于样本之间的比较，P值小于0.05认为有统计学意义。　　结果：①成功建立乌拉坦诱发小鼠肺癌模型在乌拉坦初次处理后第6周，小鼠肺脏尚未形成肿瘤；病理学结果显示，肺组织仅出现炎症细胞渗出等轻微改变。乌拉坦初次处理后第12周，9只乌拉坦处理组小鼠中共出现29个肺肿瘤，肺肿瘤发生率分别为90％；乌拉坦初次处理后第24周，10只乌拉坦处理组小鼠中共出现60个肺肿瘤，肺肿瘤发生率为100%，肺肿瘤经病理学鉴定为腺癌。②Solexa小RNA测序结果分析分别构建首次乌拉坦处理后第24周肺癌及癌旁组织小RNA文库，用Solexa高通量测序技术分别测序，共获得12495829和13903875条原始读数。对Solexa测序获得的原始数据进行去接头、污染序列以及低质量序列处理，在肺癌以及癌旁组织中分别获得了12176432和13553560条干净序列（reads）读数。长度分布统计结果表明，两个文库中小 RNA序列主要分布在18-30nt之间，其中以22 nt长度序列所占的比例最高，符合miRNA特征。将获得的干净reads片段与Genbank数据库、Rfam数据库进行比对，除去其中可能的rRNA、scRNA、snoRNA、snRNA和tRNA；剩下的reads片段通过与重复序列进行比对，除去不同类型的重复序列；再按照rRNA etc> known miRNA> repeat> exon> intron优先级顺序对sRNA进行分类注释；通过与miRBase Release14.0数据库比对，在乌拉坦处理组肺癌组织中共获得436个成熟miRNAs，176个miRNAs*，在癌旁组织中共获得421个成熟miRNAs，165个 miRNAs*；运用 Mireap软件预测到肺癌旁及癌组织中均有表达的9个新miRNAs。③肺组织miRNA差异表达分析以差异倍数（log2 ratio)>1.0、P<0.01作为筛选标准并将癌及癌旁组织中表达量都高于1的miRNA纳入差异表达分析。针对肺癌及癌旁组织中共表达的389个miRNAs进行差异分析，相对于癌旁组织，82个miRNAs在癌组织中表达显著性上调2倍以上；133个miRNAs在癌组织中表达显著性下调2倍以上；174个miRNAs表达在两组之间，差异性无统计学意义。对癌或癌旁组织中检测到的389个已知miRNAs，在两样本之间进行公共及特有表达的miRNA分析，结果显示，7个miRNAs在癌组织中特有表达，4个miRNAs在癌旁组织中特有表达。④实时荧光定量PCR内参基因选取运用TaqMan实时荧光定量 PCR方法检测乌拉坦处理组肺癌及癌旁组织U6snRNA基因的CT值，结果表明，肺组织中U6snRNA CT约为19；肺组织中U6snRNA基因的CT值在两组之间无统计学差异；TaqMan实时荧光定量 PCR检测乌拉坦处理组血清以及对照组血清中miR-16基因的CT值，结果表明，血清中miR-16的CT值约为21；血清中miR-16基因的CT值在两组之间，也无统计学差异。⑤候选miRNA的基因表达水平分析结果表明，相对于癌旁组织，肺癌组织中miR-127、miR-433的表达水平都显著性上调，而miR-1a、miR-34c在肺癌组织中的相对表达水平都显著下调；miR-193表达在两组之间，无统计学差异。⑥乌拉坦诱发小鼠肺癌过程中不同时间点的肺组织 miR-1a表达分析乌拉坦处理Balb/c小鼠之后第6周，相对于正常对照组小鼠（n=10）肺组织，miR-1a在乌拉坦处理组小鼠（n=10）肺组织中表达显著性下调；乌拉坦处理 Balb/c小鼠之后第12周，与正常对照组小鼠肺组织相比，乌拉坦处理组小鼠肺癌旁组织中miR-1a表达水平显著性下调；在乌拉坦处理组小鼠肺癌组织中miR-1a的表达水平也显著性下调；正常对照组小鼠肺组织与乌拉坦处理组小鼠肺癌组织相比， miR-1a表达显著性下调；乌拉坦处理Balb/c小鼠之后第24周，相对于正常对照组小鼠（n=10）肺组织，在乌拉坦处理组小鼠肺癌组织（n=10）中miR-1a表达显著性下调；但是在乌拉坦处理组中小鼠癌旁组织中miR-1a表达水平差异没有统计学意义。乌拉坦处理组小鼠肺癌旁组织与乌拉坦处理组肺癌组织相比，miR-1a的表达水平显著性下调。⑦肺癌细胞系中miR-1a表达分析相对于16HBE细胞，人肺癌细胞系A549、H1299、H446中miR-1a表达水平显著下调，差异有统计学意义。⑧乌拉坦诱发小鼠肺癌过程中不同时间点血清miR-1a表达分析运用实时定量PCR检测乌拉坦处理小鼠之后的第6周、12周、24周三个时间点对照组以及乌拉坦处理组小鼠血清miR-1a的相对表达水平，结果表明，在每个相应的时间点，相对于正常对照组小鼠（n=10）血清，miR-1a在乌拉坦处理组小鼠（n=10）血清中表达都显著性下调。　　结论：⑴获得小鼠暴露于乌拉坦第24周的肺癌及癌旁组织中miRNA差异表达谱，表明环境致癌剂乌拉坦能诱导miRNAs表达改变。⑵乌拉坦诱发小鼠肺癌过程中肺组织 miR-1a表达下调以及肺癌细胞系中miR-1a表达抑制，提示miR-1a可能作为抑癌基因参与乌拉坦诱导肺癌的发生发展。⑶乌拉坦诱发肺癌不同时期血清miR-1a维持表达下调状态，提示miR-1a与肺癌密切相关，可能作为乌拉坦诱导小鼠肺癌发生的潜在生物标志物。