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血友病A是一种临床最为常见的遗传性出血性疾病，由 F8基因突变而导致凝血因子VIII蛋白量的异常或功能异常，为X连锁隐性遗传。F8基因突变谱广泛，导致重型血友病A的基因缺陷主要有：内含子22倒位（约占45％）、内含子1倒位（约占2-5%）、错义突变（15%）、无义突变（10%）、小片段缺失及插入（16%）、大片段缺失（3-5%）、剪切位点突变（3%）及未知突变（5%）等。本研究对10例疑似 F8基因大片段缺失及13例未知基因突变，1例异常内含子1倒位，1例His99Arg点突变的血友病A家系进行表型诊断、家系调查、基因分析等，探讨其分子发病机制。 首先，本研究对23个血友病A家系中23例先证者（10例疑似F8基因大片段缺失及13例未知基因突变）及16例女性进行拷贝数变异检测。23例血友病A患者中10例疑似F8基因大片段缺失及9例未知基因突变的患者诊断为重型血友病A，其余4例未知基因突变患者中1例为中型及3例为轻型血友病A。运用AccuCopy多重荧光竞争PCR法证实10例患者存在F8基因大片段的缺失，并在13例未知基因突变中发现5例F8基因大片段重复的病人，其余8例病人F8基因拷贝数正常。运用AccuCopy多重荧光竞争PCR法对16例女性进行携带者检测，发现4例F8基因大片段缺失及5例大片段重复的女性携带者。通过运用长链PCR，引物步移策略，基因组步移技术精确定位10例F8基因大片段缺失病人断裂点的位置，发现在8例缺失断裂点融合处存在微小同源序列，5例缺失在断裂点融合处插入了部分碱基，推测非同源末端连接及微小同源介导的复制依赖的重组机制为本研究中F8基因大片段缺失的主要机制。运用RepeatMasker，RepeatAround，QGRS MAPPER，Z-HUNT Online，Fuzznuc等软件对断裂点区域进行生物信息学分析发现一些重组相关的元件（重复元件，非-B DNA构象形成元件，重组相关基序等）可能对缺失的发生发挥了一定的作用。 在导致重型血友病A的F8基因突变中，内含子1倒位约占2%-5%。内含子1倒位主要是由F8基因内含子1中一段1040 bp的序列（Int1h-1）与F8基因上游约125 kb的一段同源序列（Int1h-2）发生染色体内的同源重组而导致的。本研究运用序列特异PCR对内含子1倒位检测，发现一种新的异常内含子1倒位形式：正常形式的Int1h-2（1191 bp）和倒位形式的Int1h-1/2（1776 bp）同时存在，而缺少正常形式的Int1h-1（1908 bp）和倒位形式的Int1h-2/1（1323 bp）。AccuCopy多重荧光竞争PCR显示先证者F8基因26个外显子拷贝数均正常。运用长链PCR、引物步移策略、基因组步移技术、Affymetrix CytoScan CNV芯片技术及DNA实时荧光定量 PCR技术来检测并分析此异常1号内含子倒位的重组机制。此复杂重组包含一段2556 bp序列的缺失，188.9 kb二倍体重复和38.4 kb的三倍体重复，并伴有Int1h-1/2倒位的发生，推测微小同源介导的复制依赖的重组（FoSTeS/MMBIR）和非等位基因同源重组机制共同介导了此次异常重组机制的发生。基因组步移技术发现内含子1的断裂点位于154231824（hg19），并与F8基因上游260kb左右的154604422（hg19）相连，F8基因1号内含子缺失2556 bp序列。运用Affymetrix CytoScan CNV芯片技术显示F8基因上游260 kb存在一段188.9 kb拷贝数增为2的区域中共有3个基因，分别为VBP1，RAB39B和CLIC2，并没有导致病人血友病A以外的其他表型。 统计分析约有5%-10%的HA患者FVIII活性检测结果与临床出血程度不符，本研究对1例His99Arg突变患者FVIII:C检测结果差异大及一期法和二期法 FVIII活性检测结果不相符的病人进行了分子发病机制的研究。基于 APTT途径的一期法和基于发色底物法途径的二期法检测FVIII活性，发现先证者一期法（14.7%）与二期法（1.2%）FVIII活性检测结果相差十倍以上。在不同温度条件（37℃，25℃，4℃，-20℃，-80℃）下，患者血浆 FVIII在较短的时间内活性会迅速丧失；56℃热变性分析显示突变蛋白重链和轻链解离速度比正常人快3倍左右。F8基因分析发现患者存在g.30716 A>G突变而导致His99Arg氨基酸改变。三维结构模型对FVIII蛋白A1和A3亚基结合面上疏水作用的分析显示，His99被A1亚基4个氨基酸残基（Ala100，Val101，Tyr105及 His161）侧链形成的疏水作用构架所包绕，并与A3亚基的His1957，Ser1959和Leu2001形成的疏水作用构架相互作用。His99Arg突变引起A1和A3亚基间疏水作用的破坏而使FVIII空间结构发生变化，可能导致FVIII重链和轻链解离速度加快。His99Arg突变后FVIII活性的稳定性显著下降，进一步造成常规条件下FVIII活性检测结果变化大及一期法和二期法FVIII活性检测结果的不相符。