目的:2型糖尿病（T2DM）是全球患病率较高的代谢性疾病,可促进多种肿瘤尤其是肝癌的发生发展。药物流行病学研究发现不同降糖药物对肝癌起到不同的作用:例如胰岛素可增加肝癌的发病率并恶化肝癌患者的预后;但是二甲双胍在降低肝癌发病率同时,对其远期预后的影响并不一致。有限的临床研究发现二甲双胍对早期肝癌的预后有改善效果,而对晚期肝癌的预后则有进一步恶化的作用。二甲双胍对中期肝癌的影响尚未明确,有待进一步研究。目前中期肝癌的主要治疗方式是肝动脉化疗栓塞术或肝动脉栓塞术（Transcatheter arterial chemoembolization or embolization,TACE或TAE）,可以引起肿瘤组织缺氧和代谢性应激。本实验室的前期研究发现二甲双胍联合糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖可促使肝癌细胞死亡。因此本研究拟通过体外细胞实验和裸鼠肝癌皮下移植瘤模型,研究二甲双胍对肝癌细胞在代谢性应激（葡萄糖缺乏）下存活的影响,深入研究二甲双胍联合葡糖糖缺乏导致肝癌细胞死亡的作用靶点及机制。方法:首先,选用人肝细胞癌Hep G2、HCC-M、Hep3B和Huh7细胞作为研究对象。分别使用二甲双胍（Metformin,Met）或胰岛素（Insulin）对多种肝癌细胞株预处理12小时后,培养于含有不同浓度葡萄糖的培养液或给予葡萄糖转运酶抑制剂,检测二甲双胍和胰岛素对葡萄糖缺乏诱导肝癌细胞死亡的影响。其次,以Hep G2细胞为后续机制研究的细胞,通过检测线粒体氧化应激损伤指标、溶酶体功能,以及PP2A-GSK3β-Mcl-1通路的变化,从而阐明二甲双胍联合葡萄糖缺乏导致肝癌细胞死亡的作用机制。最后,利用裸鼠肝癌移植瘤模型,给予二甲双胍和葡萄糖转运酶抑制剂,通过检测裸鼠皮下肝癌移植瘤生长大小及相关免疫组化等指标,进一步验证二甲双胍在体内联合葡萄糖转运酶抑制剂诱导肝癌细胞死亡的作用。1.糖尿病药物联合葡萄糖饥饿对细胞死亡作用的研究:经碘化丙啶（PI）染色后,通过流式细胞仪检测二甲双胍和胰岛素处理后联合葡萄糖缺乏引起的细胞死亡情况;运用乳酸脱氢酶释放实验以及克隆形成实验评估二甲双胍联合葡萄糖缺乏对肝癌细胞生存和增殖的影响;并通过免疫印迹法检测凋亡相关蛋白,使用凋亡抑制剂以鉴定联合处理诱导的细胞死亡形式。2.线粒体功能的检测:经四甲基罗丹明甲酯（TMRM）和JC-1染色,使用流式细胞术检测线粒体膜电位;使用H2DCFDA（DCF）和Mito SOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator（Mito SOX）染色检测活性氧簇（ROS）的产生;腺苷三磷酸（ATP）试剂盒检测ATP的生成;使用透射电镜检测糖尿病药物联合葡萄糖缺乏处理下线粒体损伤情况。3.溶酶体功能的检测:经Lyso Tracker Red和Cathepsin B染色后,使用流式细胞术检测二甲双胍联合葡萄糖缺乏干预后溶酶体酸性以及活性的变化。4.PP2A-GSK3β-Mcl-1分子通路的探究:使用蛋白印迹法检测Mcl-1及其上游蛋白PP2A和GSK3β蛋白的表达;通过GSK3β抑制剂处理探究此通路对二甲双胍联合葡萄糖缺乏诱导的肝癌细胞死亡的作用。5.葡萄糖转运酶抑制剂与二甲双胍的联合作用:检测正常肝细胞和多种肝癌细胞内葡萄糖转运酶SGLT2和GLUT1的表达水平;观察SGLT2抑制剂卡格列净（Canagliflozin,Cana）联合二甲双胍对肝癌细胞存活的影响以及ROS生成情况,从而验证使用葡萄糖转运酶SGLT2抑制剂代替葡萄糖缺乏的可行性。6.构建裸鼠皮下肝癌移植瘤模型:Hep G2细胞种植到裸鼠皮下形成移植瘤。使用卡格列净（30 mg/kg）来模拟葡萄糖缺乏的作用,从而在动物体内验证二甲双胍和葡萄糖缺乏的协同作用。灌胃给药干预2周,期间监测肝癌转移肿瘤生长情况、血糖波动水平以及体重改变;使用免疫组化技术检测肿瘤组织中细胞凋亡和增殖情况,并提取组织蛋白通过免疫印迹法分析关键蛋白的表达水平。结果1.二甲双胍联合葡萄糖缺乏对肝癌细胞有显著的促进死亡作用,且葡萄糖浓度越低,细胞死亡越明显;乳酸脱氢酶（LDH）的释放相应升高。而胰岛素则对长时间葡萄糖缺乏所致细胞死亡具有保护作用。二甲双胍联合葡萄糖缺乏处理后,通过蛋白印迹法检测到凋亡相关蛋白caspase被活化,PARP发生剪切;而加入泛caspase抑制剂（Z-VAD-FMK）,以及caspase-8抑制剂（Z-IETD-FMK）和caspase-9抑制剂（Z-LEHD-FMK）后,可以反转PARP蛋白的改变,并有效抑制了二甲双胍联合葡萄糖缺乏所诱导的细胞死亡,提示二甲双胍联合葡萄糖缺乏诱导的死亡主要为细胞凋亡。2.二甲双胍联合葡萄糖缺乏处理后,流式细胞仪和荧光显微镜结果一致提示胞内和线粒体内ROS聚集明显增加。ROS抑制剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）预处理则可以逆转线粒体ROS的增加,进而抑制了二甲双胍联合葡萄糖缺乏所导致的肝癌细胞死亡。与此同时,流式细胞术发现线粒体膜电位明显下降以及线粒体膜通透性增加;线粒体产生的能量代谢产物ATP水平明显下降,导致细胞缺乏基本能量供应从而死亡。在电镜下观察到线粒体形态发生肿胀,线粒体嵴破坏。以上结果一致证明二甲双胍联合葡萄糖缺乏可引起线粒体损伤和功能缺失。3.通过对溶酶体功能的研究发现,二甲双胍联合葡萄糖缺乏引起溶酶体Lysotracker Red染色下降,提示溶酶体p H上升;同时Cathepsin B染色显示溶酶体内组织蛋白酶活性明显降低。两组数据一致表明二甲双胍联合葡萄糖缺乏可抑制溶酶体功能。溶酶体功能降低,无法有效清除受损线粒体,进一步加剧细胞内ROS积聚程度。4.细胞实验结果发现二甲双胍联合葡萄糖缺乏可导致抗凋亡蛋白Mcl-1表达量明显降低,进一步研究发现其上游信号通路的肿瘤抑制因子蛋白磷酸酶-2（PP2A）表达量明显上升而糖原合成酶激酶3β（GSK3β）的磷酸化（Ser 9,为其非活化形式）水平被抑制。加入GSK3β抑制剂Ⅷ（AR-A014418）或抑制剂Ⅻ（TWS119）均可保护肝癌细胞免于二甲双胍联合葡萄糖缺乏诱导的死亡。这一系列结果提示PP2A-GSK3β-Mcl-1通路对联合用药导致的肝癌细胞死亡具有重要作用。5.大部分肝癌细胞（Huh7、Hep G2、SNU-182和SNU-387）相较于正常L02细胞均高表达SGLT2;GLUT1则在所有测试细胞中都有表达。运用葡萄糖转运酶SGLT2抑制剂卡格列净和GLUT1抑制剂根皮素（Phloretin,Phl）模拟葡萄糖缺乏作用,分别使用两药联合二甲双胍,可促进肝癌Huh7细胞死亡,且呈葡萄糖浓度依赖性;卡格列净联合二甲双胍同样可见ROS升高。以上结果提示卡格列净可以模拟葡萄糖缺乏的效果。6.裸鼠肝癌移植瘤造模成功后,使用卡格列净联合二甲双胍干预15天后,观察到卡格列净联合二甲双胍可以抑制移植瘤的生长;组织样本免疫组化方法检测到Ki-67阳性细胞数减少,Tunel阳性细胞数增多,提示组织内肝癌细胞增殖能力下降且凋亡增加;提取肿瘤组织蛋白,通过免疫印迹发现抗凋亡蛋白Mcl-1表达量减少,PP2A表达升高,GSK3β磷酸化水平降低,与体外实验结果一致。结论1.二甲双胍可以促进葡萄糖缺乏引起的caspase依赖性的细胞死亡,而胰岛素对长时间葡萄糖缺乏所诱导的细胞死亡则呈现保护作用;2.二甲双胍联合葡萄糖缺乏可通过ROS积聚、线粒体损伤以及线粒体凋亡途径促进细胞死亡;3.二甲双胍联合葡萄糖缺乏抑制溶酶体活性,受损线粒体无法得到有效清除,促进ROS进一步增加;4.二甲双胍联合葡萄糖缺乏可通过调节PP2A-GSK3β-Mcl-1信号通路,从而诱导细胞死亡;5.卡格列净可以模拟葡萄糖缺乏的作用,联合二甲双胍发挥协同作用,从而诱导肝癌细胞死亡;6.二甲双胍联合卡格列净抑制裸鼠移植瘤肿瘤生长并促进肿瘤细胞死亡。