【摘 要】
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目的:探讨甲基转移酶METTL3（methyltransferase like 3）对内皮祖细胞（Endothelial progenitor cells,EPCs）生物学特性及血管生成的影响,深入探索METTL3是否通过介导m6A甲基化从而影响EPCs血管生成,为进一步阐明EPCs血管分化机制提供参考。方法:1.组织免疫荧光染色检测甲基化转移酶METTL3在牵张成骨组和骨折对照组的表达情况。2.
【基金项目】
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项目名称:lncRNA和MicroRNA调控胚胎内皮祖细胞Notch、BMP、Wnt信号通路参与牵张成骨血管发生的机制研究,项目合同编号:81870748,项目来源:国家自然科学基金面上项目,项目起止时间:2019.01至2022.12
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目的:探讨甲基转移酶METTL3（methyltransferase like 3）对内皮祖细胞（Endothelial progenitor cells,EPCs）生物学特性及血管生成的影响,深入探索METTL3是否通过介导m6A甲基化从而影响EPCs血管生成,为进一步阐明EPCs血管分化机制提供参考。方法:1.组织免疫荧光染色检测甲基化转移酶METTL3在牵张成骨组和骨折对照组的表达情况。2.犬骨髓来源的EPCs的体外分离培养和功能鉴定:密度低度离心法分离获取幼龄犬EPCs后:（1）倒置显微镜下观察犬EPCs形态学特点;（2）DIL-FITC双荧光染色鉴定EPCs胞内标记物;（3）Matrigel基质胶成管实验检测EPCs的成管能力;（4）Transwell实验检测EPCs迁移功能;3.免疫荧光染色检测甲基化转移酶METTL3是否在EPCs有所表达及胞内定位。4.构建慢病毒质粒介导METTL3基因过表达及沉默载体并转染犬EPCs后:测定感染最佳MOI;采用细胞周期流式检测EPCs细胞周期;qRT-PCR和Western Blot检测METTL3基因过表达和沉默的转染效率。5.采用CCK8分别检测正常对照组（Control组）、过表达阴性病毒对照组（OE-Control组）、过表达组（OE-METTL3组）、沉默阴性病毒对照组（sh-Control组）及沉默组（sh-METTL3组）的增殖能力;Matrigel基质胶成管实验和Transwell分别检测METTL3对EPCs成管能力和迁移功能的影响;m6A比色法检测各组的甲基化水平,探索METTL3表达量与m6A甲基化修饰的相关性;qRT-PCR和Western Blot检测成熟体miR-21、miR-27b、miR-205、miR-486表达差异和成血管相关因子VEGF、bFGF及信号通路PI3K/AKT mRNA和蛋白表达量,研究METTL3的表达量与成熟体miRNA的关系及对成血管相关因子VEGF、bFGF及PI3K/AKT信号通路的影响。结果:1.METTL3在牵张成骨组的牵张区新生组织中的表达高于骨折对照组。2.体外分离培养和根据生物学特性鉴定EPCs:EPCs的形态于镜下呈长梭形或多角形;DIL-FITC双荧光染色显示具有摄取乙酰化低密度脂蛋白和结合荆豆凝集素-1的能力;Matrigel基质胶成管实验显示铺在Matrigel基质胶的EPCs具有形成管腔样结构的能力;EPCs具有一定的迁移能力,并随着时间推移,细胞迁移增多。3.METTL3在EPCs呈阳性表达,且主要定位于胞核内。METTL3的表达量与m6A甲基化丰度呈正相关,METTL3含量越大,m6A甲基化程度越高;m6A甲基化丰度与EPCs的功能特性有关,MEETL3表达量上升,上调了m6A甲基化丰度,促进了EPCs的增殖、迁移和管形成能力;MEETL3表达量下降,m6A甲基化丰度下调,抑制了EPCs的增殖、迁移和管形成能力。4.miRNA qRT-PCR检测结果显示,与Control组相比,miR-21表达趋势随着METTL3上调而呈上升趋势（P<0.01）,随METTL3下调而呈下降趋势（P<0.05）,差异有统计学意义;miR-27b表达量随着METTL3上调而呈上升趋势（P<0.05）,随METTL3下调而呈下降趋势（P0.05）。5.mRNA qRT-PCR和Western Blot检测结果均显示,与Control组相比较,成血管相关因子VEGF、bFGF、PI3K和AKT表达量与METTL3水平呈正比,在METTL3过表达组中均呈上调趋势,而在METTL3沉默组中呈下调趋势,且差异有统计学意义。结论:1.本实验表明甲基转移酶METTL3与甲基化m6A甲基化丰度有关,并通过m6A甲基化修饰调控miR-21和miR-27b成熟体的表达;2.METTL3可通过介导m6A甲基化修饰激活PI3K/AKT信号通路,从而促进EPCs的血管生成。
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