论文部分内容阅读
近十年来,通过电纺丝(Electrospinning)技术制备的能仿生组织细胞外基质(ECM)中纤维组分的纳-微米级细度的超细纤维,已在组织工程与再生医学(TERM)领域引起极大兴趣。但传统电纺丝方法中射流的不稳定鞭动对制备取向性超细纤维,以用于构建人体组织中纤维呈规整排列的结构特异性组织(如血管、骨、肌腱等)是一个挑战,这不利于在分子、细胞及组织等多层次上精准探究仿生纤维支架的组成-结构-性能等因素对细胞功能的调控作用、作用机理及组织再生功效。通过调控纺丝液的粘弹性,我们之前发展了一种可制备高度取向的超细纤维制备方法?稳定射流电纺丝(SJES)法,这不仅会有助于解决电纺纤维在TERM应用中存在的一些关键问题(如细胞长入问题),更为高仿生化构建结构特异性组织提供了较好的研究平台。本研究基于SJES法制备的高度取向超细纤维,主要是经不同层次的结构设计、生物活性成分修饰和力学性能(刚度调控)处理后,依次探讨这些仿生有序纤维对解决传统电纺纤维支架存在的细胞3D长入问题,对调控血管平滑肌细胞(v SMCs)的收缩型表型发展和血管再生功效,以及对人源间充质干细胞(h MSCs)的成骨分化、成肌腱分化的影响及作用机制。具体研究内容如下:(1)采用SJES法和传统平行电极法(PES)制备了不同取向特征的左旋聚乳酸(PLLA)取向纤维,通过对纤维形貌(SEM)、热学(DSC)、结晶(XRD)、分子取向(P-FTIR、WAXD)、力学性能等的表征,系统地比较了这两种方法制备的取向纤维的性能差异。结果表明,SJES法相比PES法制备的取向纤维,不仅纤维的取向度高,而且具有更高的分子取向度及力学性能,满足用于构建结构特异性组织时对纤维取向度和力学性能的要求。(2)针对传统电纺丝方法制备的纤维支架不利于细胞的3D长入问题,我们利用SJES法结合X-Y平台技术打印制备了纤维直径在2?m左右的、孔径可调的、结构规整的、沉积厚度可控的三维PLLA超细纤维支架。重点研究了工艺参数(如:X-Y平台移动速度、注射速率、接收距离等)对构建3D有序大孔支架的影响。制备的3D有序大孔纤维支架可以促进模型细胞v SMCs的黏附、铺展、沿着纤维方向生长、增殖以及长入支架内部。该工作说明基于SJES的仿生超细有序纤维3D沉积技术在解决传统电纺纤维支架存在的细胞3D长入问题方面有较好的可行性,可以用于3D组织的仿生构建。(3)利用SJES制备了具有壳芯结构的透明质酸(HA,壳层)/聚乳酸(PLLA,芯层)取向纳米纤维,研究了HA的纤维表面涂层修饰对调控v SMCs向收缩表型发展的促进作用。体外评价结果表明,经HA功能化的PLLA取向纳米纤维可显著促进v SMCs的取向生长、增殖、及肌动蛋白(?-SMA)、肌球蛋白重链(SM-MHC)、弹性蛋白(Elastin)的表达。将HA/PLLA纤维制成周向取向管状支架(直径3 mm,仿生天然血管的中层结构)移植到兔颈动脉缺损6周后,免疫荧光染色结果显示,?-SMA阳性细胞(v SMCs)沿着支架内壁周向生长,在HA/PLLA血管支架表面有内皮层形成,且在支架内部有毛细血管生成。这些结果说明用高度取向的HA/PLLA纤维通过仅仅构建血管的平滑肌层结构就能调控和增强v SMCs向正常的收缩型表型发展和血管再生,这为提高组织工程血管的再生功效提供了新的思路和方法。(4)通过退火处理改变SJES法制备的PLLA取向纤维的刚度,研究了纤维刚度变化对h MSCs的分化影响及机制。结果表明:高纤维刚度有利于促进h MSCs的取向生长、增殖;能够促进成骨分化特异性转录因子RUNX2的表达而降低肌腱分化特异性转录因子scleraxis(SCX)的表达,且有利于h MSCs的成骨分化;高纤维刚度有利于AKT(Serine/threonine Kinase,AKT)的活化、YAP(Yes-associated protein)及YAP相关转录因子(ANKRD1,CTGF)的表达;而抑制AKT的活化,则显著降低YAP及RUNX2的表达;有趣的是,我们发现高纤维刚度有利于巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)的表达,而抑制MIF,则显著抑制AKT的磷酸化;因此揭示了纤维刚度诱导h MSCs成骨分化是通过MIF介导的AKT/YAP/RUNX2信号通路的作用机理。(5)制备了采用肌腱ECM主要成分修饰的仿生取向纤维,体外研究了该功能化仿生纤维对h MSCs成肌腱分化的影响。也就是,通过SJES法制备了经肌腱ECM主要成分I型胶原(COL1)和硫酸软骨素(CS)修饰的PLLA壳芯超细取向纤维支架。对h MSCs在PLLA,COL1(壳)/PLLA(芯)及COL1-CS(壳)/PLLA(芯)纤维支架上的生长进行形貌观察、细胞增殖及成肌腱分化检测,结果表明,COL1-CS(壳)/PLLA(芯)取向纤维能够促进h MSCs的铺展与增殖,基因水平肌腱相关基因SCX,TN-C及COL1呈高表达,标志性蛋白(TNMD)也表现为高阳性表达率,证明该仿生纤维支架具有优良的成肌腱诱导能力。进一步在引入力学刺激条件下培养,发现力学信号可以协同生物信号诱导h MSCs肌腱分化。而且,我们发现TGF-?信号相关分子TGF?2,TGF?3,TGFBRII,Smad3在COL1-CS(壳)/PLLA(芯)纤维支架上高表达,说明COL1-CS(壳)/PLLA(芯)纤维诱导成肌腱分化是通过TGF?/Smad3/SCX信号通路进行。综上所述,本研究采用SJES法制备了力学性能优良的高度取向PLLA仿生超细纤维可满足特异性组织工程支架的要求;SJES法结合X-Y平台可设计制备有序超细3D大孔PLLA纤维支架用于3D组织再生;HA功能化取向PLLA超细纤维有利于v SMCs的健康表型表达及血管再生;取向超细PLLA纤维的刚度通过MIF介导的AKT/YAP/RUNX2信号通路诱导h MSCs成骨分化;COL1-CS功能化取向超细PLLA纤维可通过TGF?/Smad3/SCX信号通路诱导h MSCs向肌腱分化。因此,本研究证明了基于SJES发展的不同仿生超细有序纤维,不仅对诱导特定的结构特异性组织的细胞分化与组织再生有明显的作用功效,而且为揭示仿生有序纤维的作用机理提供了理想的研究平台,在今后实现不同结构特异性组织的仿生构建及组织再生机制研究中具有重要应用价值。