论文部分内容阅读
近年来的研究发现,肿瘤干细胞的存在可能是肿瘤无法治愈的主要原因。肿瘤干细胞长期处于G0期,对作用于细胞分裂期的多数化疗药物不敏感。肿瘤干细胞具备普通干细胞的性质,受外界环境刺激后可分化形成新的肿瘤细胞,促进肿瘤生长和肿瘤复发。此外肿瘤干细胞较强的成瘤特性,被认为是肿瘤体内转移的主要原因。因此,靶向并清除肿瘤干细胞,成为肿瘤治疗的难点与热点。本研究旨在通过纳米制剂技术,靶向肿瘤干细胞、克服其耐药性,达到杀伤肿瘤干细胞,提高化学药物的抗肿瘤药效的目的。本文的主要内容如下:采用无血清悬浮球培养法,从乳腺癌细胞系MCF-7中富集乳腺癌肿瘤干细胞(Breast cancer stem cells,breast CSCs)。获得的细胞球结构致密、边界清晰,直径约200μm。经检测具备breast CSCs表面分子标记物CD44+/CD24-的细胞比例为36.51%,干性基因Nanog、OCT4及SOX2的转录与蛋白表达均出现上调,耐药蛋白ABCG2表达增强,证实该方法实现了肿瘤干细胞的富集。低分子量壳聚糖硬脂酸嫁接物(Stearic acid-g-chitosan oligosaccharide,CSOSA)形成的糖脂纳米粒在细胞球上具有较强的摄取和渗透能力,可将药物阿霉素(Doxorubicin,DOX)递送到细胞球的内部。酸性磷酸酶试验法(Acid phosphatase assay,APH assay)检测细胞球的存活率,结果表明糖脂载药纳米粒(CSOSA/DOX)比市售盐酸阿霉素制剂(DOX·HCl)有更强的细胞球生长抑制作用,其IC50值分别为1.07和2.64μg/mL。本文分别构建了 MCF-7原位肿瘤动物模型及细胞球原位肿瘤动物模型,研究发现两类肿瘤模型有较大的区别。细胞球肿瘤组织中,细胞成分组成复杂、呈细胞多样性,可致原位乳腺结构重塑,具备一定的耐药性且微环境间质丰富,结构上更接近于原发肿瘤。为使相关研究更接近于临床,本课题采用细胞球肿瘤模型,并选择多周期给药方案。结果显示,第一治疗周期,市售制剂抑瘤效果强于糖脂载药纳米粒。从第二周期开始,市售制剂组肿瘤体积继续增大,糖脂载药纳米粒组肿瘤体积基本不变,两组肿瘤的体积差逐渐缩小。第三周期结束时,糖脂载药纳米组的抗肿瘤效果显著优于市售制剂组(**p<0.01)。CSOSA/DOX在杀灭非breast CSCs的同时,可同时杀灭breast CSCs,不会导致肿瘤干细胞的富集;市售制剂对照只能杀灭非breast CSCs,肿瘤干细胞比例由10.95%升高至69.36%。CSOSA/DOX还可通过影响肿瘤相关成纤维细胞活性,减少胶原蛋白的分泌,破坏肿瘤微环境的完整性,导致肿瘤血管数量增多变粗,进一步提高抗肿瘤药效。采用MCF-7肿瘤动物模型,考察多周期给药对肿瘤耐药的影响。研究发现,经过三周期的连续给药治疗,CSOSA/DOX组呈现更强的肿瘤生长抑制作用,其效果优于DOX·HC1。DOX·HC1组肿瘤组织P-gp蛋白表达明显上调,CSOSA/DOX组肿瘤观察不到明显P-gp。采用高剂量脉冲法及低剂量连续刺激法,制备细胞耐药模型,模拟体内产生耐药的过程。DOX·HC1刺激组,细胞对药物的敏感性下降,高剂量与低剂量刺激法获得的细胞其IC50值由0.27±0.04μg/mL升高为0.80±0.03及0.88±0.07μg/mL,耐药能力增强。CSOSA/DOX刺激的细胞,对药物的敏感度变化不大。与体内结果相似,CSOSA/DOX不会诱导细胞P-gp蛋白表达上调。研究发现,CSOSA/DOX不影响mdr1基因的转录水平,而市售制剂可刺激mdr1基因转录P-gp mRNA。低剂量刺激及高剂量刺激上调后的转录水平,分别为敏感MCF-7细胞的6154倍及1191倍,显示CSOSA/DOX通过不增加P-gp蛋白表达水平,减少耐药的发生。脂质纳米载体,以其良好的生物相容性及对难溶性药物较强的包载能力,广泛应用于抗肿瘤治疗。本文选用抗肿瘤药物奥沙利铂(Oxaliplatin,OXA)及肿瘤干细胞特异性药物盐霉素(Salinomycin,SAL)联合治疗肝癌。A54多肽通过PEG链段与脂肪链段十八胺(Octadecylamine,ODA)相连,合成A54-PEG-ODA嫁接物。A54-PEG-ODA嫁接物通过其疏水端插入固体脂质纳米粒(Solid lipid nanoparticle,SLN),构建A54多肽修饰的脂质纳米粒(A54-PEG-SLN)。通过形成奥沙利铂磷脂复合物,实现A54-PEG-SLN对OXA的有效包封。投药量为5%时,载药量和包封率分别为3.46±0.12%和65.3±1.9%。研究表明,,A54多肽修饰的纳米粒,可加快BEL-7402细胞的摄取速度,并具有摄取该细胞的特异选择性。A15适配体可特异性识别肿瘤干细胞标志物CD133分子且亲和力强,本文通过A15的端氨基与NH2-PEG-SLN/SAL脂质纳米粒表面的端氨基反应,制备A15修饰的纳米粒A15-PEG-SLN/SAL。该纳米粒对难溶性药物盐霉素可有效包封,投药量为10%时,载药量及包封率分比为7.77±0.28%和84.42±0.55%。体外细胞药效表明,游离奥沙利铂及A54-PEG-SLN/OXA纳米粒对BEL-7402细胞的IC50值分别为8.11±1.5及16.0±1.2μg/mL;包封后药效下降,可能与药物的释放有关。游离盐霉素对肿瘤干细胞杀伤作用不明显,主要由溶剂二甲亚砜导致;而A15-PEG-SLN/SAL纳米粒肿瘤干细胞药效显著IC50值为0.69±0.015μ/mL。A15-PEG-SLN/SAL纳米粒对BEL-7402细胞杀伤能力较弱,10μg/mL时存活率为80%。考虑到BEL-7402细胞对盐霉素不敏感,在进行体内抗肿瘤药效序贯给药研究时,采用先给予奥沙利铂制剂,杀伤肿瘤敏感细胞,使肿瘤干细胞暴露出治疗位点。当连续给药两个周期后,肿瘤干细胞比例由0.1%升高至3.0%,此时再给予盐霉素制剂。模型动物药效学研究结果显示,A54多肽修饰A54-PEG-SLN/OXA纳米粒的抗肿瘤作用增强,与游离奥沙利铂相当。联合盐霉素给药后,制剂组抗肿瘤药效显著优于游离药物组。本论文研究结果表明,CSOSA/DOX在肿瘤的多周期治疗中,发挥良好的抗肿瘤作用,杀伤肿瘤干细胞,抑制肿瘤复发。A54-PEG-SLN/OXA与A15-PEG-SLN/SAL联合疗法,增强化疗药物OXA的抗肿瘤药效,发挥协同作用,有效治疗肝癌。