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背景及目的自抗生素发现并不断应用于临床治疗以来,细菌的耐药性不断增加,从而降低了抗生素的有效性,增加了临床上疾病的治疗难度,成为影响世界公共卫生以及医疗保健等相关的主要问题。超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)是一组可以水解青霉素,头孢菌素和氨曲南的酶,是引起革兰氏阴性细菌对超广谱β-内酰胺类抗生素产生耐药性的主要因素之一。碳青霉烯类药物可用于治疗各种产ESBL的肠杆菌科细菌分离株引起的感染。但是,由于碳青霉烯类药物的滥用,使得耐碳青霉烯类药物的肠杆菌科细菌不断涌现,给临床治疗增加了负担。肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(KPC)酶是A类碳青霉烯酶中最重要的酶,能水解碳青霉烯类药物,产KPC酶的细菌引发的感染可导致患者病死率升高,这无疑给临床诊断和治疗带来极大的挑战。肺炎克雷伯菌是革兰氏阴性细菌,是诸如肺炎,败血病和尿路感染等医院获得性感染和社区获得性感染的最常见病原菌。由于当今世界对抗生素的广泛使用所产生的选择压力,医院中分离到的肺炎克雷伯菌多为多重耐药菌,出现由其引起的医疗保健相关感染治疗困难,尤其是对碳青霉烯类药物耐药的肺炎克雷伯菌(CRKP)的出现,使得感染治疗难度显著增加。据报道,CRKP的广泛传播通常与移动元件的水平转移密切相关,肺炎克雷伯菌具有很高的获取可移动遗传元件的能力,例如获取含有抗生素抗性基因的质粒等。鉴于其较高的传播能力,CRKP感染对中国的临床抗菌疗法构成了实质性威胁。CRKP感染的发生一般认为与患者的身体状况、是否存在并发症、入院时间长短、是否使用侵入性设备进行治疗以及抗生素用药史等有关,但对于CRKP感染,肠道定植菌的重要性及其传播耐药机制也尚未明确。前人研究表明,肠道定植CRKP是医院院内感染的重要危险因素之一。本研究拟通过连续观察一特定的重症患者不同时间的肠道定植CRKP,利用药敏试验,全基因组测序等手段获取感染菌株的毒力以及耐药性数据,力图阐明肠道定植CRKP在该特定患者体内的耐药及分子特征。研究结果可为肠道定植CRKP的发生及诊治提供新的思路,对于感染的早期预防与控制具有重要的科学价值。方法本研究连续五年从浙江大学医学院附属第一医院重症监护室(ICU)病房收集一特定病人粪便样本65份,对采集到的粪便样本进行细菌的分离鉴定,共分离到88株CRKP。对分离到的目标菌株进行药敏实验获得细菌的耐药表型,通过质粒的脉冲场凝胶电泳(S1-PFGE)和DNA印记染色(Southern blot)实验确定KPC基因是否位于质粒上并确定质粒大小。对分离到的细菌进行基因组测序拼接以及分析,确定细菌携带的耐药基因,毒力基因、MLST型别,KPC所在的基因环境以及系统发育分析等。结果1.本研究共从收集到的65份粪便样本分离出CRKP 88株。使用PCR扩增CRKP中的碳青霉烯类耐药基因,扩增及测序结果显示,88株CRKP均为blaKPC基因阳性。2.药敏结果显示,88株携带blaKPC-2的肺炎克雷伯菌中有86株细菌对碳青霉烯类药物表现耐药,另外两株细菌对碳青霉烯类药物敏感。绝大多数细菌对哌拉西林/他唑巴坦,头孢噻肟,头孢他啶,头孢匹罗,氨曲南,环丙沙星表现为耐药,对庆大霉素,妥布霉素,阿米卡星,替加环素及磷霉素表现为敏感。3.S1-PFGE与blaKPC-2基因的Southern印迹杂交结果表明,细菌携带的blaKPC-2基因均为质粒介导。这些临床菌株中携带blaKPC-2基因的阳性质粒不少于6种。菌株中存在的携带blaKPC-2的质粒,质粒大小在28.8kb～1 73.4kb的范围内,常见的质粒大小为～54.7kb,～78.2kb和～138.9kb。4.MLST结果显示,88株CRKP中有60株为ST11型,有28株为ST37。并且88株CRKP中携带多种耐药基因,其中包括喹诺酮类,磺胺类,氨基糖苷类,磷霉素类,β 内酰胺类,大环内酯类,替加环素类等相关耐药基因。不仅如此,细菌还携带诸多毒力基因,如88株CRKP中均携带有分别编码1型和3型菌毛的fim基因和mrk操纵子基因以及菌毛蛋白基因ecp。5.88株肺炎克雷伯菌中存在6种不同的baKPC-2的基因环境,具有共同的blaKPC-2侧翼保守序列:klcA-hp-hp-hp-blaKPC2-ISKpn27-Tn3。系统发育分析结果表明,此研究涉及的CRKP大体分为两支,一支为ST11型CRKP,另一支为ST37型CRKP,且分支内菌株间具有SNP差异,说明该患者体内CRKP的克隆性微进化。结论1.本研究共收集CRKP88株,均携带blaKPC基因,其中86株对碳青霉烯类药物耐药,表明产KPC酶的肺炎克雷伯菌在该患者肠道稳定定植。此外,肠道定植CRKP具有广泛的多重耐药性,携带有多种耐药基因及毒力基因,增加了临床诊断和治疗的难度。2.携带blaKPC-2的质粒在不同菌株之间的大小差异很大,blaKPC-2基因多位于质粒且周围有移动元件,具有传播风险,klcA-hp-hp-hp-blaKPC-2-ISKpn27-Tn3为保守序列。3.该患者体内分离到的CRKP具有SNP差异,说明患者在住院期间使用抗菌药物进行治疗的过程中,细菌已经发生进化变异。