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粉尘螨(Dermatophagoides farina)过敏原Der f1，属于木瓜蛋白酶类半胱氨酸蛋白酶家族，是最为常见的气传性致敏原之一，是诱发过敏性哮喘、过敏性鼻炎等过敏性疾病的重要因素。特异性免疫治疗（SIT，也称脱敏治疗）是目前唯一针对过敏性疾病病因，并长期缓解病症的治疗方案。目前SIT主要采用过敏原粗提液，但由于其提取物成分复杂、批次不稳定等因素，导致脱敏原标准化困难，严重影响了过敏性疾病的治疗效果和临床应用规范，因此发展更加安全、稳定、可靠的重组过敏原蛋白用于临床应用和基础研究变得尤为迫切。本研究通过基因工程方法克隆、表达、复性、纯化含有前肽的粉尘螨过敏原蛋白pro-Der f1，利用螨过敏病人血清研究重组pro-Der f1与血清中IgE的反应情况，并结合生物信息学分析Der f1蛋白三级结构、氨基酸组成性质及B细胞抗原表位。主要的研究内容如下所述: (1)构建含有StrepⅡ亲和标签的pro-Der f1蛋白表达载体，在大肠杆菌中经IPTG诱导表达获得分子量约35 kDa的蛋白，Western blot鉴定表明该蛋白即为pro-Der f1。经过表达条件优化，其在IPTG终浓度为0.2 mM，37℃条件下诱导培养6h时，蛋白表达量最大。在此条件下，pro-Der f1蛋白主要以包涵体的形式表达。 (2)包涵体经6M尿素变性溶解后，分别用稀释复性、尿素梯度的分子排阻层析(size exclusion chromatography, SEC)复性和非尿素梯度SEC复性这三种方法对pro-Der f1蛋白进行复性。通过比较发现，采用非尿素梯度SEC复性效果最好。经过条件优化，在非尿素梯度SEC复性过程中，复性缓冲液中含有3 mM还原型谷胱甘肽(GSH)和0.3 mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)，蛋白上样量控制在15 mg，洗脱速度控制在0.3 ml/min时，复性效果较好。复性产物经StrepⅡ标签亲和柱纯化后，基本无杂带。 (3)用10个螨过敏病人血清分别检测经稀释复性与非尿素梯度SEC柱复性后pro-Der f1蛋白的IgE结合活性，结果显示非尿素梯度SEC复性后的pro-Derf1蛋白IgE结合活性明显高于稀释复性。 (4)用MEGA5.2软件对螨组1过敏原蛋白Der f1与其它过敏原蛋白等进行同源性分析，运用邻位相连法构建系统进化树，结果显示其与屋尘螨过敏原蛋白Der p1同源性最高，表明它们之间可能存在交叉反应。用SWISS-MODEL中的同源建模功能构建蛋白三级结构模型，显示Der f1主要由两个球状结构域所组成，酶活性中心则位于两个球状结构域之间。用DNAstar软件对Der f1蛋白二级结构、亲水性、灵活性、抗原指数等进行分析，从而确定其B细胞抗原表位为:11-23、29-35、54-113、123-135、147-171和192-204。