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慢性内脏痛是肠易激综合征(IBS)的临床重要症状之一,发病机制尚未阐明,临床上缺乏有效的治疗手段。G蛋白偶联受体激酶(GRK)6是一种通过磷酸化激活的G蛋白偶联受体(GPCR),催化GPCRs失敏的重要调节蛋白,其表达下调参与炎性痛和神经病理性疼痛的调控,但是机制不清,GRK6在IBS慢性内脏痛中的表达和作用尚无报道。Micro RNA微阵列芯片筛选出在发育期易感性基因中,发现miR-19a与GRK6的3’UTR有互补序列。临床流行病学调查以及动物实验研究均表明:发育关键期的不良环境刺激是个体成年后IBS患病的重要诱因。表观调控能够应答不良内外环境信号,介导环境因素对基因表达的中、长期的表型改变,参与慢性疼痛的调控。那么miR-19a是否通过表观调控机制发挥“新生期再编程效应”,通过负向调控靶基因GRK6的表达参与新生期结肠炎性刺激(NCI)诱导的成年慢性内脏痛的形成,有待于我们深入研究。1.研究目的(1)研究GRK6在NCI诱导的慢性内脏痛中的作用。(2)筛选预测调控GRK6的发育期易感性micro RNA。(3)研究NCI模型中miR-19a与GRK6的靶向调控关系。(4)研究miR-19a是否参与NCI诱导的慢性内脏痛敏的形成。(5)探讨miR-19a表达上调的DNA去甲基化机制。2.实验方法(1)以出生10天的雄性SD大鼠为对象,肛门处插入2 cm导管,结肠内注射0.2ml的0.5%稀乙酸来建立内脏痛觉高敏的模型,注射等容量的生理盐水作为对照。待大鼠成年(6周)后,运用腹壁撤回评分(AWR score)和扩张阈值(Distention threshold,DT)方法评测NCI大鼠的痛行为反应。(2)运用HE染色方法检测结肠壁的炎症反应以及结构变化。(3)运用Western Blot方法检测NCI大鼠肠相关DRG中GRK6的表达变化。(4)运用免疫荧光组织化学方法检测GRK6在肠相关DRG中的细胞定位。(5)鞘内注射GRK6过表达慢病毒和miR-19a antagomir检测NCI内脏痛敏行为,以确定GRK6和miR-19a是否参与NCI诱导的内脏痛敏。(6)结肠管壁注射荧光素(Dil)来逆行标记结肠特异性DRG神经元,运用全细胞膜片钳方法检测过表达GRK6的神经元兴奋性。(7)应用Real-time PCR方法检测大鼠肠相关的DRG中miR-19a、GRK6、DMNT1/DNMT3a、DNMT3b、Gadd45a、MBD1、MBD2、MBD4和TDG的m RNA表达水平。(8)通过micro RNA微阵列芯片筛选发育期易感性基因。(9)运用双荧光素酶报告基因检测实验验证miR-19a和GRK6的靶向关系。(10)运用荧光原位杂交结合免疫荧光组织化学的方法检测miR-19a的细胞定位以及和GRK6是否有细胞共定位。(11)应用MSP(甲基化特异性PCR)和BSP(重亚硫酸氢盐测序PCR)检测大鼠肠相关的DRG中miR-19a基因启动子区的甲基化状态。3.实验结果(1)NCI诱发大鼠6周时出现显著的内脏痛觉过敏。(2)GRK6在NCI大鼠肠特异性DRG神经元中的表达显著下调。(3)过表达GRK6能够显著缓解NCI诱导的成年慢性内脏痛敏,并且能够显著翻转NCI诱发的肠特异性神经元的兴奋性增高。(4)NCI大鼠肠相关DRG中TDG表达显著上调,但DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、Gadd45a、MBD1、MBD2、MBD4的表达没有明显变化。.(5)micro RNA芯片筛选出10个显著变化的发育期易感性micro RNAs。(6)结合靶基因聚类GO分析软件以及靶基因预测软件预测GRK6是miR-19a可能的靶基因,双荧光素酶报告基因检测实验证明了miR-19a和GRK6的靶向关系。(7)NCI诱导miR-19a表达上调,miR-19a与GRK6在肠相关DRG神经元中有共定位。(8)鞘内注射miR-19a antagomir能够显著缓解NCI诱导的慢性痛敏,并且显著翻转NCI大鼠肠相关DRG中GRK6的表达。(9)miR-19a主要分布于痛觉相关的IB4以及CGRP标记的中小型神经元。(10)NCI大鼠肠相关DRG中miR-19a基因启动子区Cp G岛发生明显的去甲基化,推测可能与TDG高表达相关。4.结论(1)背根神经节中GRK6的表达下调可能参与NCI诱导的内脏痛敏的形成。(2)新生期结肠炎性刺激诱发发育期易感基因miR-19上调,靶向调控GRK6下调,参与NCI诱导的慢性内脏痛觉过敏。(3)TDG表达上调,引起miR-19a基因启动子区Cp G岛去甲基化,可能是其表达上调的表观调控机制。(4)研究结果首次阐述了micro RNA的DNA甲基化机制在慢性内脏痛形成中的作用,为功能性胃肠疾病的“发育源疾病学说”提供理论依据,有望为IBS慢性内脏痛的临床治疗提供新的药物靶点。