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背景:慢性肾脏病（chronic kidney disease,CKD）已经是危害全球人类身体健康的主要疾病之一,肾间质纤维化（renal interstitial fibrosis,RIF）是各种原因导致慢性肾脏病肾组织结构损坏及滤过功能损伤的病理进展过程。大黄-黄芪药对广泛运用于临床中CKD的治疗,RIF是CKD终末期共同病理途径,目前西医暂无治疗RIF的特效药物,故研究挖掘抗RIF药物至关重要。课题组前期根据全国70余名老中医用药经验数据深入挖掘分析,在治疗CKD的药物中频率最高的2味药物为:黄芪和大黄。国医大师郑新也用大黄-黄芪药对作为肾衰灵方的重要组成成分,在临床治疗CKD取得了良好的治疗效果。故课题组为阐述大黄-黄芪药对治疗CKD的作用机制是否与其抗RIF相关是本实验的研究重点。本实验旨在:（1）通过现代化各种数据库对大黄和黄芪对RIF的多成分、多靶点、多途径的治疗作用进行网络药理学分析,构建“复方药物-化学成分-靶目标-疾病”的网络。（2）通过动物实验,验证大黄黄芪煎剂对RIF大鼠的潜在作用机制。（3）通过体内外实验,揭示大黄酸通过抑制SHH信号通路改善RIF的作用机制。第一部分网络药理学分析大黄-黄芪药对治疗肾间质纤维化作用分析目的:通过网络药理学分析评价大黄-黄芪药对治疗CKD-RIF的作用靶点。方法:本课题采用超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）分析DHHQD化学成分,中药系统药理学数据库TCMSP、文献查阅、质谱等分析DHHQD化学成分及作用靶点。结合OMIM和Gene Card数据库获取“renal interstitial fibrosis”疾病靶标。应用R软件对DHHQD与RIF中获取的药物与疾病靶点,寻找交集靶点基因并作Venny图。利用Cytoscape3.5.1软件构建出有效成分和靶标的可视化网络。通过STRING数据库行PPI蛋白网络构建。通过DAVID数据库、京都基因与基因组百科全书数据库对靶标行生物过程、细胞组分和分子功能的GO富集分析及信号通路的KEGG富集分析。结果:结合质谱分析,通过网络药理学各数据库筛选,共收集了631个潜在的病理生理靶点,包括经常被研究的基因,如MAPK、NOS、MMP、STAT、PPAR、SOD、EGFR和IL6。与疾病靶标取交集后最终得到139个共同靶基因。建立药物-化学成分-靶标-疾病目标网络,蛋白质-蛋白质相互作用网络（PPI）各靶标之间存在2615个相关关系,分析中确定的大多数靶点也与炎症如MAPK3/8、IL-6和JUN和细胞凋亡如AKT、VEGFA、EGFR和EGF等密切相关,通过GO分析观察到靶基因富集的氧化应激（GO:0006979）、细胞对氧化应激的反应（GO:0034599）和活性氧（GO:0034614）与炎症密切相关,另外,对机械刺激的反应（GO:0009612）、凋亡信号通路的调节（GO:2001233）、对辐射的反应（GO:0009314）和细胞对外部刺激的反应（GO:0071496）与纤维化呈正相关。KEGG分析中131个靶点被定位到123个KEGG通路中,包括AKT/PI3K信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路、凋亡、HIF-1信号通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药性和Toll样受体信号通路。通过对数据和相关生物学过程的分析,筛选出20个意义最高的GO及KEGG信号通路。结论:通过整合DHHQD的质谱及网络药理学分析,发现DHHQD可以通过多组分、多靶点、多途径治疗CKD-RIF。该研究后续动物实验DHHQD治疗CKD-RIF的潜在作用机制提供了理论基础。第二部分大黄-黄芪药对通过PI3K/AKT信号通路抑制肾间质纤维化的作用机制研究目的:通过大黄-黄芪煎剂（dahuang-huangqi decoction,DHHQD）干预UUO模型大鼠,探讨其抑制RIF的潜在作用机制。方法:建立肾间质纤维化大鼠UUO模型,随机分组:假手术组（Sham）、UUO组、大黄-黄芪药对高剂量组（DHHQD-H,20 m L/kg/d）、大黄-黄芪药对低剂量组（DHHQD-L,10 m L/kg/d）组。除假手术组以外,将其余3组大鼠均进行UUO造模,暴露大鼠左侧输尿管并直接解剖结扎,DHHQD组大鼠分别予以不同浓度中药汤剂灌胃持续14天。实验结束,收集各组大鼠血清行肾功能检测,采集肾组织切片进行HE染色、Masson染色、PAS染色及透射电镜观察,评价大鼠肾组织病理性损伤、纤维蛋白沉积及肾小球硬化等改变,通过ELISA、WB和q PCR检测相关蛋白和m RNA的表达。结果:与UUO组相比,DHHQD给药的大鼠血尿素氮和血清肌酐水平降低,肾小管萎缩和坏死,间质纤维化,细胞外基质增生及异常沉积,系膜基质和肾小球基底膜微观结构等病理改变得到改善。通过免疫组化检测通过DHHQD治疗后显著降低了UUO大鼠转化生长因子-β1（TGF-β1）和α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）,提示DHHQD可改善UUO组肾功能和肾间质纤维蛋白沉积。结合网络药理学分析报告,通过ELISA检测DHHQD降低了UUO大鼠e NOS、IL-6、EGFR和VEGF蛋白的表达,并降低了参与炎症通路的核心靶点,如PI3K、AKT、TLR4、NF-κB蛋白和RNA的表达。DHHQD治疗通过潜在地调节PI3K/AKT和TLR4/NF-κB信号通路来改善RIF的严重程度。结论:DHHQD通过调节PI3K/AKT和TLR4/NF-κB信号通路的活性,抑制RIF程度,保护肾功能。第三部分大黄酸通过SHH信号通路抑制肾间质纤维化的作用机制研究目的:通过大黄酸干预UUO模型大鼠,探讨其抑制肾间质纤维化（RIF）的潜在作用机制。方法:建立RIF大鼠UUO模型,随机分组:假手术组（Sham）、UUO组、大黄酸（Rhein）组。除假手术组以外,将其余2组大鼠均进行UUO造模,暴露大鼠左侧输尿管并直接解剖结扎,Rhein组大鼠予以Rhein（2mg/kg/d）灌胃持续14天。监测大鼠肾功能相关指标,组织学检测肾组织病理学指标。采用HE染色测定α-SMA、TGF-β1的表达,采用q PCR和WB法定量检测SHH、Gli1和Snail的表达。体外实验将NRK-49F细胞与SHH共孵育48小时。将SHH激活的NRK-49F细胞与环巴胺或大黄酸孵育。检测Gli1、Snail的m RNA和蛋白水平。结果:动物在体实验结果显示Rhein可以改善UUO可引起的肾功能异常及肾脏病理损害。与未经治疗的UUO组相比,大黄酸组肾小管萎缩和坏死、间质纤维化、细胞外基质异常沉积和增生显著减少。大黄酸降低UUO大鼠SHH、Gli1和Snail的RNA和蛋白质表达。细胞实验中,CNP或Rhein处理降低了SHH诱导的NRK-49F细胞中Gli1和Snail的m RNA和蛋白质表达,表明CNP或Rhein抑制了SHH诱导的NRK-49F细胞中SHH信号通路的激活。结论:大黄酸通过抑制SHH-Gli1-Snail信号通路,显著改善了UUO大鼠RIF。