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细菌鞭毛蛋白是近几年来备受关注的一种新型免疫佐剂。鞭毛蛋白和TLR5受体结合可激活机体的先天免疫应答反应,从而发挥免疫佐剂活性。但是,鞭毛蛋白充分发挥其免疫佐剂活性是否需要完整的鞭毛蛋白结构以及各结构域在其免疫佐剂活性上发挥怎样的作用仍存在争议。因此,本研究以产肠毒素大肠杆菌F4ac菌毛主要结构亚基FaeG为模型抗原,将其与大肠杆菌鞭毛蛋白的不同结构域:包括全长FliCH7(aa1-585aa)、N端保守区FliCN(aa1-174aa)、N端和中间的高变区FliCNV(aa1-496aa)融合表达,然后通过检测融合蛋白的体外TLR5受体活性、免疫小鼠后抗FaeG特异性抗体水平来综合评价大肠杆菌鞭毛蛋白各结构域在其发挥免疫佐剂活性中的作用,旨在进一步阐明鞭毛蛋白发挥免疫佐剂活性的机制,并为临床上更高效利用鞭毛蛋白提供研究参考。1.嵌合基因的构建、原核表达及鉴定本研究利用重叠延伸 PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR)成功构建了出血性大肠杆菌参考株EDL933(O157:H7)鞭毛蛋白FliCH7的全长(aa1-585aa)、N端保守区FliCN(aa1-174aa)、N端和中间的高变区FliCNV(aa1-496aa)与产肠毒素大肠杆菌F4ac+参考株C83902(O8:K88:H19)主要亚单位FaeG串联表达的嵌合基因:FliC-FaeG、FliCN-FaeG和FliCNV-FaeG;分别将其克隆至pET28a(+)表达载体中,再转化至大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌中进行IPTG诱导表达;利用SDS-PAGE和Western blot对表达的重组蛋白进行鉴定。PCR结果显示,三个嵌合基因的大小分别为:2619 bp、1386 bp和2352 bp;SDS-PAGE结果显示,融合蛋白的分子量大小分别约为:90 KDa、48 KDa和80 KDa,均与预期大小一致。Western blot结果表明,三种融合蛋白均能被anti-FaeG的单克隆抗体识别;抗FliCH7抗体能识别FliC-FaeG和FliCNV-FaeG融合蛋白,但是不能识别FliCN-FaeG融合蛋白。融合蛋白的体外TLR5受体活性检测结果表明:在相同条件下,FliC-FaeG融合蛋白能刺激人肠道上皮细胞系Caco-2细胞产生更高水平的IL-8和TNF-α。大肠杆菌鞭毛蛋白FliCH7不同结构域与FaeG融合蛋白的成功构建和鉴定,为进一步研究大肠杆菌鞭毛蛋白的免疫佐剂活性机制以及不同结构域与其免疫佐剂活性的相关性提供了研究基础。2.大肠杆菌鞭毛蛋白不同结构域免疫佐剂活性研究为研究大肠杆菌鞭毛蛋白不同结构域免疫佐剂活性在体内是否存在差异性及其发挥免疫佐剂活性的可能机制,我们将原核表达后纯化的FliC-FaeG、FliCN-FaeG、FliCNV-FaeG融合蛋白、FaeG蛋白+弗氏佐剂乳化后分别颈部皮下免疫8周龄的BALB/c雄性小鼠,ELISA检测各免疫组小鼠血清中抗FaeG的特异性抗体水平。ELISA结果显示:首次免疫后第7天,即能刺激各组小鼠产生针对FaeG的特异性抗体,而且随着免疫次数的增加,抗体水平稳步提高。其中,FaeG+弗氏佐剂组和FliCN-FaeG组FaeG抗体水平相当,均显著高于FliC-FaeG组和FliCNV-FaeG组(p<0.01)。间接ELISA测定各组免疫小鼠脾脏细胞经外源抗原刺激后产生的TNF-α和IL-4水平,结果表明:FliC-FaeG组和FaeG+弗氏佐剂组在相应的抗原刺激下,能诱导产生更高浓度的TNF-α,显著高于FliCN-FaeG组(p<0.001)和FliCNV-FaeG组(p<0.001)。各组产生的IL-4水平并无统计学差异(p>0.05)。荧光定量方法,检测各组TLR5相关促炎性因子mRNA的表达情况,结果显示,FliC-FaeG组和FaeG+弗氏佐剂组中IL-6和TNF-α的表达显著高于FliCN-FaeG组(p<0.01)和FliCNV-FaeG组(p<0.01),表明炎症基因的转录和表达与鞭毛蛋白TLR5受体活性密切相关,小鼠体内促炎性反应信号途径的激活仍需要其完整的鞭毛蛋白结构。3.免疫小鼠血清对F4ac+ETEC黏附仔猪小肠上皮细胞的抑制作用F4ac+ETEC是引起仔猪腹泻的主要病原菌,F4菌毛是其主要的毒力因子。F4菌毛与仔猪肠上皮细胞受体结合是F4ac+ETEC感染的第一步和关键环节。为研究上述融合蛋白免疫后诱导的特异性抗FaeG抗体是否能有效阻断F4ac+ETEC对仔猪小肠上皮细胞的黏附,我们以仔猪肠道上皮细胞IPEC-1和IPEC-J2为体外细胞感染模型,细菌黏附抑制结果表明:与PBS对照组相比,含有抗FaeG抗体的免疫组小鼠血清均能显著抑制F4ac+ETEC对两个细胞系的黏附。其中,FliCN-FaeG组和FaeG+弗氏佐剂组的血清比FliC-FaeG和FliCNV-FaeG免疫组血清能更高效的抑制F4ac+ETEC菌株对两个细胞系的黏附(p<0.01),但是FliCN-FaeG 组和 FaeG+弗氏佐剂之间(p>0.05),以及 FliC-FaeG 组和 FliCNV-FaeG组之间无统计学差异(p>0.05)。以上结果表明FliCN-FaeG融合蛋白将来可以优先作为预防F4+ETEC感染疫苗的候选蛋白。