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琼胶寡糖具有抗肿瘤、抗氧化和调节肠道菌群等多种生物活性,而微生物来源的琼胶酶是酶法制备琼胶寡糖的重要工具酶。目前报道的琼胶酶数量较少,而具有优良酶学特性的琼胶酶数量更少,极大阻碍了酶法制备琼胶寡糖的工艺开发进程,因此有必要发掘更多微生物来源的新颖琼胶酶。本文分别从3株海洋细菌中挖掘到3个新型琼胶酶基因,克隆并成功表达后对纯化琼胶酶的酶学性质进行了分析;同时研究了从红藻中制备琼胶寡糖的工艺,包括红藻的预处理方法、液料比、匀浆时间、加酶量和加酶时间;最后使用核磁共振和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱对酶解产物进行了分析。主要研究内容及结论如下:（1）从副居冰菌属Paraglaciecola hydrolytica、中华黄海杆状菌Gilvimarinus chinensis、海黏假交替单胞菌Pseudoalteromonas mariniglutinosa中挖掘到3个新型的琼胶酶Aga9、Aga16和Aga2,生物信息学分析表明,这3个琼胶酶均没有跨膜区域,且存在信号肽（19～20）,并含有GH16家族的保守结构域,由此说明它们可能属于GH16家族的分泌型胞外蛋白。（2）利用PCR扩增得到aga9、aga16和aga2基因,将其构建至表达载体p ET28a（+）,并在大肠杆菌表达系统中成功进行可溶性表达。分别对Aga9、Aga16和Aga2进行蛋白表达优化。结果表明Aga9的最优表达条件为:诱导剂浓度90μmol/L,诱导温度20℃,诱导时间12 h;Aga16的最优表达条件为:诱导剂浓度90μmol/L,诱导温度20℃,诱导时间9 h;Aga2的最优表达条件为:诱导剂浓度90μmol/L,诱导温度20℃,诱导时间9 h。（3）使用镍亲和层析纯化蛋白,获得纯度较高的Aga9、Aga16和Aga2。底物特异性分析表明,Aga9、Aga16和Aga2只有在底物是琼脂糖时,才有明显的水解活性,由此进一步确定了这3个重组酶均为琼胶酶,并具有很好的底物专一性。（4）分别对纯化后的Aga9、Aga16和Aga2进行了酶学性质分析。Aga9在40℃时水解效率最高,在该温度下放置5 h,仍保留71.35%的相对酶活力,表现出较好的热稳定性。其最适反应p H为8.0,在不同p H（4.0～8.0）下放置5 h后,仍具有70.59%以上的相对酶活力,具有良好的p H稳定性。该酶在Ba2+、K+浓度为1 mmol/L时活力略有增强,在K+、Fe2+、Co2+、Ca2+、Ni2+、Mg2+、Ba2+、SDS、Uera、DTT、Triton X-100（1 mmol/L）存在时,可以保持73.71%以上的活性,表明其对大多数金属离子耐受。当Na Cl浓度为3.0 mo L/L时,Aga9仍保留82.16%以上的相对酶活力,具有较强的盐耐受性。Aga16在50℃时活性最好,相比于Aga9的最适温度提高了10℃,表明其在应用中更具优势。Aga16在40℃的条件下放置5 h,仍保留71.77%的相对酶活力,与Aga9的热稳定性相当,且表现出良好的耐热性。其最适反应p H为6.0,相比于Aga9的最适p H降低了2.0,说明其可在弱酸性环境中发挥作用。该酶在p H 5.0～p H 9.0下放置5 h后,仍保持67.90%的相对酶活力。当Na Cl浓度为3.0 mo L/L时,Aga16仍保留82.35%以上的相对酶活力,具有较强的盐耐受性,且与Aga9盐耐受性相当。Aga2在50℃时酶解效率最好,相比于Aga9的最适温度提高了10℃,表明Aga2可在50℃的特定温度下发挥酶解活性。在温度为40℃下分别放置4 h后,仍然剩余54.62%的相对酶活力,但与Aga9和Aga16相比,Aga2的热稳定性稍弱。该酶的最适p H为6.0,和Aga16的最适p H相同,且在p H 4.0～p H 9下放置5 h后,其相对活性可保留62.58%。在Zn2+、K+、Ca2+、Ni2+、Mg2+、Ba2+、SDS、Uera、DTT、Triton X-100（1 mmol/L）存在时,可以保持78.50%以上的相对酶活力,表明其对大多数金属离子及试剂耐受。另外,Aga2的Km为0.86 mg/m L,Vmax为0.78 U/mg,具有较好的底物亲和性。（5）以红藻为原料,利用Aga9和Aga16联合制备新琼四糖和新琼六糖。首先研究了不同预处理方式对红藻的影响,发现匀浆可以有效地破坏红藻细胞壁,释放琼胶。随后对酶解条件进行了优化,优化后的酶解工艺为:在7 g湿红藻（干重1.75g）中加入20 mmol/L的Tris-HCl（p H 7.0）至总体积为150 m L,匀浆处理15 min,一次性加入225U的琼胶酶混合酶液,在37℃反应270 min,可获得33.74 mg的琼胶寡糖。该酶解工艺有以下优点:节省时间,每批次酶解匀浆化的红藻只需要4～5小时;成本低,匀浆处理红藻不需要昂贵的设备;环境友好,与热提取、酸碱辅助法相比,匀浆化提取琼胶和酶法制备琼胶寡糖几乎不会产生污染;非破坏性,匀浆化和酶解法不会破坏红藻中的其他营养成分,这对于红藻的综合利用至关重要。本论文有效地利用了海藻资源,研究结果为开发高效率、低成本、绿色环保的琼胶寡糖规模化制备工艺奠定了坚实的基础。