蜂毒肽对膀胱癌的作用及机制研究

来源 :皖南医学院 | 被引量 : 0次 | 上传用户:hexin123456789
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目的:(1)通过CCK8法和克隆形成实验探究蜂毒肽对细胞增殖能力的影响。(2)通过细胞划痕实验以及Transwell小室实验探究蜂毒肽对膀胱癌细胞迁移、侵袭能力的影响。(3)通过q PCR和WB检测蜂毒肽对膀胱癌细胞mi R-146a、NUMB以及NOTCH2表达的影响。(4)探究在膀胱癌中过表达mi R-146a对NUMB以及NOTCH2的影响。(5)探究过表达NUMB对膀胱癌细胞增殖能力的影响。(6)通过生物信息学及检测临床标本,探究mi R-146a及NUMB的临床意义。方法:(1)采用CCK8法和平板克隆实验探究蜂毒肽对膀胱癌细胞的增殖能力,流式细胞术探究及WB检测蜂毒肽对膀胱癌细胞凋亡的影响(2)采用划痕实验及Transwell实验探究蜂毒肽对膀胱癌细胞迁移和侵袭的影响(3)采用q PCR检测蜂毒肽对膀胱癌细胞mi R-146a、NUMB和NOTCH2的m RNA水平影响;蛋白印迹技术检测蜂毒肽对膀胱癌细胞中NUMB,NOTCH2蛋白水平的影响;将mi R-146a mimic和mimic NC和NUMB的野生型及突变型质粒进行共转染,再采用双荧光素酶报告实验验证mi R-146a与NUMB的直接结合作用。(4)使用lipo2000转染mi R-146a模拟物和模拟物的对照,并用CCK8及克隆形成实验探究mi R-146a对膀胱癌细胞增殖的影响以及对NUMB和NOTCH2表达水平的影响。(5)采用lipo2000转染NUMB过表达质粒及对照质粒,并用CCK8及克隆形成实验探究mi R-146a对膀胱癌细胞增殖的影响以及对NUMB和NOTCH2表达水平的影响。(6)运用生物信息学技术分析膀胱癌组织中mi R-146a的表达情况以及q PCR检测膀胱癌组织中mi R-146a的表达情况并分析其临床意义;运用生物信息学技术、q PCR和蛋白印迹技术检测膀胱癌组织中NUMB的m RNA及蛋白表达水平并分析其临床意义。结果:(1)4μg/m L蜂毒肽处理后,相比于对照组,处理组的吸光度值明显下调(P<0.01),处理组形成的克隆团数目更少(P<0.01),且处理时间越长,抑制增殖的作用越明显;流式细胞术结果发现蜂毒肽4μg/m L处理72h后,相比于对照组,处理组的Annexin V/PI双染细胞数目比率明显增高(P<0.01);WB检测4μg/m L蜂毒肽处理48h后的凋亡蛋白水平:CASPASE9蛋白表达水平上调,BAX蛋白表达水平上调,BCL-2表达水平下调。(2)4μg/m L蜂毒肽处理48h后,相比于对照组,蜂毒肽处理过组的膀胱癌细胞迁移距离明显减短,穿过Transwell小室的细胞明显减少(P<0.01)。(3)q PCR检测4μg/m L蜂毒肽处理48h后的RNA水平,与对照组相比较,处理组mi R-146a的水平明显下调(P<0.01),NUMB表达水平上调(P<0.01),NOTCH2表达水平下调(P<0.01);WB检测4μg/m L蜂毒肽处理48h后的蛋白水平,NUMB表达水平上调,NOTCH2表达水平下调;双荧光素酶报告实验发现通过共转染psi CHECK2-NUMB-MUT与mi R-146a模拟物及模拟物的对照,两组的荧光值有明显差异(P<0.01),共转染psi CHECK2-NUMB-WT与mi R-146a模拟物及模拟物的对照,两组的荧光值无差异。(4)CCK8法及克隆形成实验发现过表达mi R-146a后影响蜂毒肽对膀胱癌细胞增殖抑制的作用;q PCR及WB发现过表达mi R-146a后影响蜂毒肽对膀胱癌细胞NUMB和NOTCH2的表达水平的调控。(5)通过CCK8实验以及克隆形成实验,结果表明过表达NUMB可以逆转mi R-146a促进增殖的作用;通过WB可以发现过表达NUMB可以逆转mi R-146a促进增殖的作用。(6)生物信息学及临床样本检测发现mi R-146a在膀胱癌中高表达,且mi R-146a与膀胱癌患者的淋巴结转移有关;NUMB在膀胱癌中低表达。结论:(1)蜂毒肽可以抑制膀胱癌细胞增殖、迁移和侵袭。(2)蜂毒肽可以调控mi R-146a/NUMB/NOTCH2轴从而影响膀胱癌细胞增殖。(3)mi R-146a-5p可以做为膀胱癌潜在的肿瘤标志物及治疗靶点。
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