第一部分人副流感病毒3型F蛋白HRB连接区结构与功能研究研究背景:人副流感病毒3型（human parainfluenza virus type3,HPIV3）为副粘病毒科（Paramyxoviridae）副粘病毒属（Paramyxovirus）病毒家族中的一种重要病毒,可引起5岁以下婴幼儿下呼吸道感染,导致支气管炎和肺炎。在病毒性呼吸道感染患者中,HPIV3的临床阳性检出率仅次于呼吸道合胞病毒（respiratorysyncytial virus,RSV）。HPIV3为包膜病毒,其遗传物质为不分节段的单负链RNA（-ssRNA）。HPIV3病毒包膜上锚定有两种与病毒毒力密切相关的蛋白,血凝素-神经氨酸酶（hemagglutinin-neuraminidase,HN）和融合蛋白（fusionprotein,F）。HPIV3 的病毒包膜与宿主细胞膜的融合是病毒感染宿主细胞的关键步骤,该过程由HN蛋白协助,在F蛋白的介导下完成。HN蛋白与宿主细胞膜上唾液酸（sialic acid,SA）受体结合后,HN蛋白激活F蛋白,继而F蛋白发生一系列不可逆构象改变,由融合前构象转变为融合后构象,在这个过程中驱动病毒包膜与宿主细胞膜的融合。F蛋白融合前三维晶体结构为一“蘑菇样”同源三聚体结构,结构域DⅠ,DⅡ,DⅢ构成蛋白头部的主体,HRB七重复基序构成蛋白的茎部。有文献表明,DⅡ与HRB之间存在一段低电子密度区,将其定义为HRB连接区,也称为F蛋白的L3连接区。虽然有大量研究对融合肽（fusion peptide,FP）,跨膜区（transmembraneregion,TM）,DⅠ,DⅡ以及DⅢ结构域的功能有所报道,但是对HRB连接区功能的研究却很少涉及。本部分研究以HPIV3 F整段HRB连接区为研究对象,探讨其结构特征,以及在介导膜融合过程中所发挥的重要作用。研究目的:研究HPIV3 F蛋白HRB连接区功能,阐明HPIV3 F蛋白HRB连接区影响膜融合功能的机制,为将来以HRB连接区为靶点的特异性药物设计以及构建对HRB连接区改造的减毒活疫苗提供参考,从而为HPIV3相关感染的治疗与预防奠定理论基础。研究方法:1.HPIV3 F蛋白HRB连接区嵌合（Chimera）、缺失（Deletion）突变体的构建:利用已知的副流感病毒5型（parainfluenza virus type 5,PIV5）F蛋白融合前构象的3D结构,采用SWISS-MODEL同源建模的方法,确定HPIV3 F蛋白HRB连接区的在整个多肽链上的相对位置与氨基酸范围。经过HPIV3 F蛋白与NDV、MV、HPIV1的F蛋白HRB连接区氨基酸序列两两比对后,利用重叠延伸PCR法分别用以上三种病毒F的HRB连接区序列替换对应的HPIV3 F HRB连接区序列,获得HPIV3 F的HRB连接区嵌合的3个嵌合突变体质粒,同时利用相同的方法获得HPIV3 F的HRB连接区缺失的1个缺失突变体质粒。研究中涉及的所有突变体质粒都经测序确认。2.突变体F蛋白在细胞内的表达:应用Thermo Fisher Scientific公司的阳离子转染试剂TurboFect Transfection Reagent将pBSK+空载体、野生型wt F质粒以及各突变体重组质粒分别转染BHK-21细胞系,利用重组痘苗病毒瞬时表达系统表达相应的突变体蛋白。3.F蛋白突变体介导膜融合活性的检测:染料转移实验和合胞体形成实验对突变体介导膜融合活性进行半定量检测,内容物混合实验对突变体介导膜融合活性进行定量检测。4.F蛋白突变体表达情况的检测:间接免疫荧光对突变体蛋白的表达情况进行定性检测,流式细胞术对突变体蛋白在细胞表面的表达效率进行定量检测。5.F蛋白突变体水解活性的检测:使用蛋白免疫印迹方法检测各突变体酶切水解活化的情况。6.统计学方法:用GraphPad Prism7.0软件采用非配对t检验对突变体F蛋白与野生型F蛋白的测定结果进行统计学比较,P<0.05认为其差别有统计学意义。研究结果:1.成功构建HPIV3 FHRB连接区3个嵌合突变体:Ch-NDV-L3、Ch-MV-L3、Ch-HPIV1-L3和1个缺失突变体:De-L3,并在突变体C端添加His组氨酸标签。2.HPIV3F蛋白HRB连接区嵌合及缺失突变体介导膜融合活性测定在染料转移实验中,野生型wtF引起引起染料转移事件平均数为98.0,Ch-HPIV1-L3则降低至29.7,其他三个突变体未能引起明显的染料转移事件。在内容物混合实验中,四个突变体引起细胞内容物混合的能力降低为wt F的16.5%～23.5%。合胞体形成实验中,除Ch-HPIV1-L3形成合胞体能力略弱于wt F外,其余3个突变体的合胞体形成能力降至wt F的5%以下。3.HPIV-3 F蛋白HRB连接区嵌合及缺失突变体表达情况测定间接免疫荧光发现抗His标签单抗检测到了添加了 His标签的全部突变体及wt F-His,而使用抗HPIV3 F蛋白单抗仅检测到了 wtF。继而采用流式细胞术,使用抗His标签单抗检测突变体蛋白在细胞表面的表达情况发现,发现带有His标签的突变体蛋白均成功表达于细胞表面,与wt F-His相较,其表达水平并没有明显的统计学差异。蛋白免疫印迹结果显示wt F-His、Ch-MV-L3-His、Ch-HPIV1-L3-His可以被水解为有活性的F1片段,而Ch-NDV-L3-His、De-L3-His则不能被水解,仍然为无活性的F0片段。结论:HPIV3 F蛋白HRB连接区氨基酸的嵌合与缺失突变对于F蛋白介导膜融合的活性影响显著,说明HRB连接区对于F蛋白正常发挥介导膜融合功能具有非常重要的作用。HRB连接区对膜融合活性的影响是通过改变F蛋白融合前构象的稳定性来实现。同时,HRB连接区还能影响F蛋白前体F0上蛋白酶识别位点的暴露,而F0被水解为有活性的F1是F执行膜融合功能的前提条件。第二部分人副流感病毒3型F蛋白DⅠ-DⅡ连接区结构与功能研究研究背景:人副流感病毒（humanparainfluenzaviruses,HPIV）为副粘病毒科副粘病毒属的主要成员之一,是引起社区获得性肺炎的重要病原体,特别是导致婴幼儿肺炎和下呼吸道疾病。根据其遗传学和血清学特点,HPIV可以分为分为1～4型,其中人副流感病毒3型（human parainfluenza virus type 3,HPIV3）是5岁以下婴幼儿下呼吸道感染的主要病因,仅次于呼吸道合胞病毒。目前,仍然没有有效的预防和治疗手段。HPIV3为不分段的单负链RNA基因组的包膜病毒。病毒包膜与靶细胞膜的融合为病毒感染的关键步骤,继而病毒将其基因组注射入宿主细胞并启动病毒复制周期。病毒的融合蛋白（F）和血凝素-神经氨酸酶（HN）是病毒进入细胞的决定因素。HN结合细胞膜上唾液酸受体,引发同源F蛋白构象变化,继而驱动膜融合。F蛋白由多个重要的蛋白结构域构成。在DⅠ与DⅡ结构域之间存在类似于“铰链”结构的连接区,即DⅠ-DⅡ连接区,也称为L1连接区,该连接区可能参与了 F蛋白介导膜融合过程中的构象转换。本课题组前期已经对HPIV3 F蛋白DⅠ-DⅡ连接区的关键氨基酸进行了定位,但尚未对DⅠ-DⅡ连接区的整体功能进行研究。研究目的:探讨HPIV3 F蛋白DⅠ-DⅡ连接区在介导膜融合过程中的作用,阐述DⅠ-DⅡ连接区影响F蛋白介导膜融合活性的机制。研究方法:以已知的PIV5病毒的F蛋白融合前构象的3D结构为模板,采用SWISS-MODEL同源建模的方法,确定HPIV3 F蛋白DⅠ-DⅡ连接区的氨基酸范围。通过多重序列比对来确定NDV,MV,HPIV1 F蛋白DⅠ-DⅡ连接区对应的碱基序列。然后使用重叠延伸PCR的方法,用NDV,MV,HPIV1 F的DⅠ-DⅡ连接区对应的碱基序列替换HPIV3 DⅠ-DⅡ连接区碱基序列,构建缺失或者嵌合的突变体。同时,在所有的突变体的C端添加His标签。采用重组痘苗病毒表达系统于BHK-21细胞系中分别表达野生型F蛋白以及各突变体蛋白。采用染料转移法测定其半融合活性,合胞体形成实验和内容物混合实验分别定性和定量测定其膜融合活性。采用间接免疫荧光定性检测突变体蛋白的表达情况,流式细胞术定量分析各突变蛋白在细胞表面的表达效率,蛋白免疫印迹检测突变体蛋白水解情况。用GraphPad Prism7.0软件进行统计学分析,实验数据以x±-s表示,应用非配对t检验对突变体与wt F的测定结果进行比较,P<0.05认为其差别有统计学意义。研究结果:1.成功构建HPIV3 F蛋白DⅠ-DⅡ连接区3个嵌合突变体:Ch-NDV-L1,Ch-MV-L1,Ch-HPIV1-L1;1个缺失突变体:De-L1。在所有突变体蛋白C端成功添加His标签。2.HPIV3的F蛋白嵌合及缺失突变体融合活性测定与同源HN共转染后,与野生型F蛋白比较,所有突变蛋白显示合胞体形成水平均不同程度降低。Ch-NDV-L1,Ch-MV-L1,De-L1几乎丧失了他们形成合胞体的能力,小于wtF水平的5.0%。而Ch-HPIV1-L1合胞体形成能力略微降低,最终仍具有形成合胞体的能力。四个突变体（Ch-NDV-L1,Ch-MV-L1,Ch-HPIV1-L1,De-L1）内容物混合能力仅保留 wt F 的 13.1%,12.4%,61.8%和 12.7%。Ch-NDV-L1,Ch-MV-L1,De-L1很大程度降低了染料转移水平,都在wt F水平的4.4%以下。嵌合突变体的Ch-HPIV1-L1的染料转移程度也降低至wt F的30.6%水平。3.HPIV-3 F蛋白嵌合及缺失突变体表达情况测定使用抗HPIV3 wtF单克隆抗体进行间接免疫荧光检测中发现,除突变体Ch-HPIV1-L1以外,突变体Ch-NDV-L1,Ch-MV-L1和De-L1均未检测到荧光信号。使用抗His标签单克隆抗体进行间接免疫荧光检测中发现所有添加His标签的突变体均检测到荧光信号,表明成功所有标记的突变蛋白的表达。使用抗His标签单克隆抗体进行FACS检测发现,所有突变体均产生一定比例表达His标签突变蛋白的阳性细胞,为wtF组的100.0%～105.1%之间,差异无统计学意义（P>0.05）。结论:1.HPIV-3 F蛋白DⅠ-DⅡ连接区的嵌合与缺失突变会导致膜融合能力的减弱甚至丧失。突变对膜融合能力的影响在融合的初期即可发生。这种影响的程度与氨基酸替换的数量相关。2.HPIV-3 F蛋白DⅠ-DⅡ连接区突变不影响F蛋白在细胞表面的表达效率,因此突变未对F蛋白在细胞内的转运过程产生影响,但是会干扰F蛋白的折叠或/和构象变化。DⅠ-DⅡ连接区在融合前虽然为自由卷曲状态,但其仍然参与F蛋白激活后的构象变化,甚至起到很重要的作用。第三部分新城疫病毒F蛋白HRB连接区关键氨基酸定位及功能研究研究背景:新城疫（Newcastle disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）引起的是一种禽类烈性传染病,具有传染性强,病死率高的特点,严重危害家禽养殖业。NDV可感染几乎所有的禽类,其中鸡最为易感,常为致死性感染,而水禽感染后可不引起明显症状,成为病毒的储存池。哺乳动物对NDV有较强的抵抗力,但人偶有感染而患结膜炎。NDV毒株的毒力差异较大,根据鸡感染后的发病严重程度,可将NDV毒株分为四种致病型:强毒株,中等毒株,低毒株和无毒株。NDV属于副粘病毒科,副粘病毒属。与该科中其他病毒一样,NDV有包膜,其遗传物质为单股不分节段的负链RNA。其基因组从3’端到5’端依次编码六种结构蛋白,分别为核衣壳蛋白（NP）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素神-经氨酸酶（HN）和大聚合酶（L）。此外,P基因在转录过程中通过RNA编辑作用产生两种非结构蛋白,V和W蛋白。病毒基因组转录和复制的活性模板为核糖核蛋白复合物（RNP）,其由NP蛋白包裹基因组RNA并与P和L蛋白结合。现已知的NDV全基因组有三种长度,分别为15186,15192或15198nt,均符合6个核苷酸倍数的规律。NDV的病毒包膜与宿主细胞膜的融合是病毒感染宿主细胞的关键步骤,两者膜发生融合后,病毒遗传物质进入细胞,完成病毒的生命周期。而该过程由位于病毒包膜上的HN蛋白协助,融合蛋白F介导。作为副粘病毒属的一种重要病毒,NDVF蛋白与副粘病毒属其他种类病毒的F蛋白具有高度相似的结构特征。本部分研究以NDV F蛋白HRB连接区为研究对象,探讨其在F蛋白介导膜融合过程中所发挥的重要作用,同时定位HRB连接区内起到关键作用的氨基酸。研究目的:研究NDVF蛋白HRB连接区的功能,阐明NDVF蛋白HRB连接区影响F介导膜融合的机制,同时定位HRB连接区内关键氨基酸。研究方法:利用已知的PIV5病毒的F蛋白融合前构象的3D结构,采用SWISS-MODEL同源建模的方法,确定NDVF蛋白HRB连接区的氨基酸范围,采用同源序列比对的方法确定L436、E439、1450、S453这四个位点氨基酸为保守氨基酸。然后采用定点突变与菌内同源重组相结合的方法对以上4个点位氨基酸进行突变,构建NDVF蛋白HRB连接区单氨基酸突变体重组质粒。采用重组痘苗病毒表达系统于BHK-21细胞中瞬时表达NDV野生型F蛋白以及各单氨基酸突变体蛋白。采用染料转移实验、合胞体形成实验以及内容物混合实验对突变体介导膜融合活性进行半定量、定量检测。采用间接免疫荧光对突变体蛋白的表达情况进行检测。采用蛋白免疫印迹对各突变体酶切水解活化的情况进行检测。最后使用非配对t检验对突变体F蛋白与野生型F蛋白的测定结果进行统计学比较,P<0.05认为其差别有统计学意义。研究结果:1.成功构建NDVF蛋白HRB连接区中保守氨基酸位点的6个单氨基酸突变体:L436A、L436T、E439A、I450A、S453A、S453N。2.NDVF蛋白HRB连接区单氨基酸突变体的融合活性测定L436A和I450A几乎丧失合胞体形成能力,仅仅为野生F的1.96%和1.33%。L436T和S453A合胞体小而少,合胞体形成能力降低至野生型的31.5%和45.6%。S453N突变后合胞体形成能力反而升高至野生型的115.7%。突变体E439A合胞体形成能力无明显的变化。L436A和I450A的半融合能力丧失,L436T、E439A,S453A,S453N均观察到明显的半融合现象。L436A、L436T、I450A的内容物混合能力降至野生型的52.14%,73.11%和51.93%。S450突变为丙氨酸（A）后,其内容物混合能力为野生型83.65%,而突变为该位点HPIV3 F蛋白所对应的天冬酰胺（N）,其内容物混合能力上升为野生型的143.58%。3.NDV F蛋白HRB连接区单氨基酸突变体表达情况测定间接免疫实验中,转染L436T,E439A,S453A和S453N质粒的BHK-21细胞中检测到明亮的绿色荧光,而转染L436A和I450A质粒的细胞只存在散在的弱荧光信号。非还原蛋白免疫印迹发现所有突变体都能被水解活化为F1,但表达量相对于野生型F蛋白均明显减少,且突变体之间蛋白表达量也差异明显。结论:NDVF蛋白HRB连接区氨基酸的突变对于F蛋白介导膜融合的活性影响显著,说明HRB连接区对于F蛋白正常发挥介导膜融合功能具有非常重要的作用,其中L436以及1450氨基酸为关键氨基酸。