社会经济不断发展,人民生活水平日益改善,然而糖尿病患病人数也持续增高,严重威胁人民的生命健康。糖尿病经常伴有严重并发症,包括心血管疾病、神经疾病、视网膜病变和肾功能衰竭,已成为致死率第三高的慢性疾病。2型糖尿病是最常见的糖尿病类型,主要病因是胰岛素抵抗或者胰岛素敏感性降低导致胰岛素分泌相对不足,糖尿病患者餐后血糖的吸收利用降低,体内血糖浓度居高不下。血糖水平的持续升高会加速体内的蛋白质非酶糖基化进程,机体组织器官内形成的晚期糖基化终末产物是糖尿病慢性并发症的发生发展的重要诱因。目前,降血糖的治疗手段和治疗药物有很多种,其中通过α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶这两种糖苷酶抑制食物中淀粉、多糖等碳水化合物的水解来延缓糖尿病患者餐后血糖的升高是临床治疗2型糖尿病的重要手段。非酶糖基化抑制剂通过阻断蛋白质糖基化过程,抑制晚期糖基化终末产物（AGEs）产生,或破坏蛋白质交联结构来抑制糖尿病并发症的发生发展。由于大部分合成的糖苷酶和非酶糖基化抑制剂在临床使用中出现较严重的毒副作用,不利于长期服用。因此,从食物资源中寻找安全有效的天然抑制剂,并阐明其抑制机理,对膳食干预糖尿病及其并发症具有重要现实意义。多种膳食多酚已被证明具备有效的降血糖功效且相对安全,多酚化合物牡荆素也被研究证明具有降血糖和抗糖基化功效,但是目前关于牡荆素对α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶及蛋白质非酶糖基化的抑制机理研究甚少。本文以膳食多酚牡荆素为研究对象,研究其对α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的抑制能力及抑制动力学,探讨牡荆素加入后对α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶两者的结构的影响进而如何影响底物结合的方式,阐明其抑制机理。此外,通过建立体外蛋白质非酶糖基化模型,探究牡荆素对糖基化不同阶段产物的抑制活性,探讨牡荆素对蛋白质功能基团、蛋白质结构的保护作用,对蛋白质氧化、蛋白质β-交联结构的抑制作用。另外,通过探讨牡荆素对亚铁离子的螯合能力、对甲基乙二醛（MGO）的捕获能力和捕获动力学,以及在牡荆素干预下,蛋白质糖基化位点和糖化度的变化,阐述牡荆素对蛋白质非酶糖基化的抑制机理。主要研究内容和结果如下:1.牡荆素抑制α-淀粉酶的IC50值为2.25 mM,其抑制能力显著弱于临床药物阿卡波糖（IC50值为16.88 μM）。牡荆素通过竞争性抑制的方式可逆地抑制α-淀粉酶的活性。淀粉-碘紫外光谱结果揭示了牡荆素不仅可以直接抑制淀粉酶活性,还可以通过与淀粉通过氢键结合形成复合物降低淀粉的消化率。牡荆素能够引起α-淀粉酶的内源荧光猝灭,25℃下的猝灭常数为（1.66±0.06）×104 Lmol-1。牡荆素与α-淀粉酶只有一个结合位点,结合常数为103数量级,表明牡荆素与α-淀粉酶具有中等强度的亲和力,结合的主要驱动力为疏水相互作用。牡荆素加入后改变了 α-淀粉酶的二、三级结构,使α-淀粉酶的α-螺旋含量降低,酶的表面疏水性减小,酶的结构变得更加松散。牡荆素降低了色氨酸残基微环境的疏水性,而对酪氨酸残基影响很弱,说明色氨酸残基对牡荆素与α-淀粉酶的相互作用影响更大。牡荆素对接于α-淀粉酶的活性空腔中,并与结合区域的氨基酸残基 Glu233、Asp197、His299、Asp300、His305 与 Ile235 等发生相互作用。根据作用力强度和自由能分解结果推断Glu233在牡荆素与酶的结合中贡献最大。分子动力学模拟结果显示加入牡荆素后,α-淀粉酶的蛋白质骨架稳定性降低,肽段350-355的灵活性显著减弱,SASA值略微增加反映了酶的表面疏水性降低,趋向于更松散的结构。牡荆素通过与α-淀粉酶结合,占据其活性空腔,与底物竞争活性位点,改变酶的构象,阻止底物进入催化中心,以此降低酶的活性。2.牡荆素抑制α-葡萄糖苷酶的IC50值为52.8 μM,其抑制活性显著强于临床药物阿卡波糖（IC50=375 μM）。牡荆素以反竞争抑制模式即通过与酶-底物复合物结合的方式抑制酶的催化活性。阿卡波糖和牡荆素的联合用药在不同的抑制水平下均对α-葡萄糖苷酶表现出有利的协同抑制作用。牡荆素与α-葡萄糖苷酶形成复合物的结合过程主要受氢键和疏水相互作用的驱动。两者的结合常数为105L mol-1,且牡荆素在酶上仅有一个结合位点。与牡荆素相互作用后,α-葡萄糖苷酶的α-螺旋量明显下降,α-葡萄糖苷酶的构象部分变得较为松散,表面疏水性降低。分子对接结果显示牡荆素在酶上的结合位点与活性位点不同,牡荆素与结合位点周围氨基酸残基 Lys16、Asn259、Glu271、Thr290、Ala292、Glu296与Leu297通过氢键结合。氨基酸化学修饰结果表明被修饰的氨基酸残基在参与牡荆素酶抑制作用的重要程度为Glu,Asn>Lys>Thr。因此,氨基酸化学修饰结合自由能分解结果推测 Lys13,Lys16,Glu271,Glu296,Asn259和Thr290在牡荆素对酶的结合和抑制作用中很重要,且Glu296在牡荆素和α-葡萄糖苷酶之间的相互作用中贡献最大。分子动力学结果表明与牡荆素形成复合物后,降低了 α-葡萄糖苷酶的稳定性,复合物的400-435肽段的灵活性增加,酶的表面疏水性下降,酶的构象变得更加松散。通过与重要的氨基酸残基相互作用,牡荆素改变了 α-葡萄糖苷酶的构象,阻止了底物及其水解产物的释放,最终抑制了酶的催化活性。3.在BSA-果糖模型中,牡荆素（500 μM）对果糖胺、α-二羰基化合物及荧光性AGEs的抑制率分别为32.58%、47.24%和72.90%,对AGEs表现出最强的抑制效果,而同浓度下氨基胍（AG）的抑制率分别为13.62%、4.86%和17.51%。尽管牡荆素对不同阶段产物的抑制能力有差异,但在不同阶段的抗糖化作用都比氨基胍强。在BSA-MGO糖基化模型中,牡荆素呈浓度依赖性有效抑制AGEs的形成,且其抑制能力显著强于临床药物氨基胍。牡荆素可以保护蛋白质巯基基团免受氧化,降低羰基化程度和蛋白质氧化产物的含量,并在糖化过程中可以一定程度上阻止蛋白质的结构变化。牡荆素有效抑制糖化过程中蛋白质聚集体和β-交联结构的形成。亚铁离子的螯合实验中牡荆素的EC50为2.51 μM强于EDTA（17.22μM）。牡荆素可以有效清除体系内的MGO,当牡荆素浓度增加到100和200 μM时,24小时后残留的MGO分别降低到4.97%和0.2%。且牡荆素捕获一个MGO分子后与其缀合形成了牡荆素的单MGO加合物。牡荆素可以结合BSA猝灭BSA的内源荧光,结合常数在104数量级。从BSA-果糖糖化样品和牡荆素处理的样品中分别鉴定了 42和43个糖化肽段。经牡荆素处理后,出现了新的糖基化位点分别为K44,K65,K211,K228和K399,而位点K235,K455,R23,R24和R359消失了,这可能源于BSA和牡荆素之间的相互作用改变了赖氨酸和精氨酸残基周围的微环境。牡荆素的抗糖化机制可能与牡荆素对蛋白质的结构保护、抑制氧化过程、捕获MGO及结合BSA改变糖化位点有关。