论文部分内容阅读
A型鸭病毒性肝炎(Type A Duck viral hepatitis)是由鸭甲肝病毒(duck hepatitis A virus,DHAV)感染导致的急性和高度致死性传染病，主要感染1～3周龄雏鸭，死亡率高达90%以上，该病有3个血清型，即DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3，3个型有着明显的差异，交叉免疫性差。其中DHAV-1型鸭病毒性肝炎呈世界性分布，是严重危害养鸭业的主要疫病之一。本研究构建了DHAV-1LY0802株的传染性克隆，并对其部分生物学特性进行了研究。1、DHAV-1LY0802株的传染性克隆的构建及病毒拯救参照GenBank上公布的序列设计9对引物，通过RT-PCR的方法获得从鸭群中分离到的DHAV-1LY0802株的忠实cDNA。其中采用RACE方法分别对5’端和3’端未知序列进行测定。测序结果与GenBank公布的序列比较后发现，同源性高达93.2%～95.2%。参考载体pCDNA3.1与病毒序列中酶切位点的位置，设计5对引物，将DHAV全基因组分为5个片段定向装配到载体上。通过引物设计的方法，在cDNA的5’端添加sp6启动子和3’端添加亲本病毒序列中不存在的酶切位点Xho后，按照顺序将其装配到pCDNA3.1载体上。通过点突变的方法优化序列最前端的AUG环境，并以此作为遗传标记以区别母本病毒与拯救病毒。按照既定顺序将LY0802株全长cDNA按顺序连接到pCDNA3.1载体上获得阳性重组子pLYDHAV，序列测定后发现有7位碱基发生突变，其中第13、19位碱基为人工诱变，用于优化AUG环境和作为遗传标记。变异碱基造成第5、7位氨基酸序列发生突变，其余突变均为无义突变。用XhoⅠ酶切重组质粒pLYDHAV进行体外转录后立即用于转染BHK-21细胞，并以母本RNA作阳性对照，以无菌PBS作为阴性对照。转染后BHK-21细胞出现明显的CPE，且用RT-PCR方法和IFA方法检测均为阳性结果。经过遗传标记的鉴定，表明造成细胞病变的是拯救病毒而非感染野毒。2、拯救病毒的部分生物学特性研究分别在转染后24、36、48、60、72h收集拯救病毒粒子。用此拯救病毒和母本病毒分别感染BHK-21细胞，测定各时段病毒的TCID50，并绘制病毒的生长曲线。生长曲线表明在转染60h后病毒复制量达到顶峰，且拯救病毒与母本病毒的生长曲线特征相似。为了研究拯救病毒的感染性，将30只1日龄的健康小鸭子分成三个组。其中1组和2组分别皮下注射0.25ml（104TCID50）的拯救病毒和母本病毒（104.2TCID50），对照组皮下注射相同剂量的无菌pH7.4的PBS。结果显示拯救病毒感染性与母本病毒相似，感染鸭临床特征明显。LY0802株DHAV-1的感染性克隆的成功构建为下一步深入开展DHAV-1的致病机理的研究奠定了重要的基础。