Bax inhibitor-1(BI-1)类蛋白是真核生物中保守的抗细胞凋亡因子,在哺乳动物中能够参与非折叠蛋白响应(UPR)途径。GAAP是Bax inhibitor-1的亚家族蛋白,植物细胞中At-GAAP对ER胁迫以及PCD的调控机制研究还比较少。拟南芥中存在五个GAAP同源基因,被分别命名为GAAP1-5。实验室前期研究发现,GAAP1能够抵抗ER胁迫以及盐胁迫,GAAP3主要在子叶以及根尖表达,并且它的表达能够被胁迫所诱导。为了进一步探究GAAPs家族中的GAAP3对ER胁迫的响应及作用机理,阐明GAAPs在植物抗性机制中所发挥的作用。本文以抑制合成糖蛋白糖链必需的拟脂中间产物生成的抑制剂tunicamycin(TM)作为胁迫诱导剂,从植物整体、细胞水平和分子水平,研究GAAP3在ER胁迫中的功能;并且通过荧光定量PCR、酵母双杂和GST-Pulldown等技术探究了GAAP3对ER胁迫的调控机理。主要研究结果如下:1、GAAP3正调控植株对ER胁迫的抗性。通过直接点种于含低浓度TM的培养基上生长和萌发后转移至TM培养基上两种方式分析,发现gaap3单突变体以及gaap1gaap3双突变体地上部分黄化率和死亡率明显高于野生型和GAAP3过量表达转化子,其中gaap1gaap3双突变体的黄化率和死亡率最高,而GAAP3过量表达转化子的黄化率和死亡率最低;通过含TM的滤纸覆盖根系,结果显示gaap1gaap3双突变体根长受抑制程度最大,而GAAP3过量表达株系则相反。进一步在细胞水平探究地上部分在TM处理条件下的活性氧水平与细胞死亡情况,突变体地上部分的DAB和台盼蓝染色最明显,而过量表达转化子的DAB和台盼蓝染色都不明显,在高倍镜下观察,发现台盼蓝染色部位主要在气孔处;通过Fluorescein diacetate(FDA)、Propidium iodide(PI)染色分析根尖细胞在ER胁迫条件下细胞活力与膜透性的改变,发现TM处理后不论是gaap3单突变体还是gaap1gaap3双突变体的细胞活力都明显降低,细胞膜透性明显改变,而过量表达株系的细胞活力降低最少,细胞膜透性改变最小。在转录水平检测发现TM处理48 h,gaap1gaap3双突变体最先诱导PCD基因的表达,与植株整体敏感性结果是一致的。这些结果都表明不论是在地上还是地下部分,GAAP3突变后对胁迫更敏感,而GAAP3过量对于ER胁迫具有一定的抵抗作用,说明GAAP3正调控植株对ER胁迫的抗性。2、GAAP3参与调控持续ER胁迫下的UPR。植物在遭受ER胁迫的时候,一般通过UPR通路来缓解胁迫,在胁迫持续或严重时会启动PCD。通过荧光定量PCR检测GAAP3是否影响了 bZIP28的靶基因和IRE1途径靶基因,发现对照处理条件下,gaap1gaap3双突变体中UPR响应基因(qSHP70、AtPDIL、AtBip3、CNX1、bZIP60s)表达都高于野生型,而且在0.5 μg·mL-1 TM处理24h前,gaap3、gaap1gaap3突变体中bZIP60s上调幅度都高于野生型,之后上调幅度下降明显,而bZIP60s在GAAP3过量表达株系中只有TM处理4 h上调幅度高于野生型,在TM处理48 h后都低于野生型,在整个胁迫进程中表达峰值低于野生型,说明GAAP3在持续ER胁迫过程中对IRE1通路的保护性反应起减弱作用,能够负调控IRE1通路。而GAAP3突变或过量在ER胁迫24 h,对bZIP28通路响应基因上调幅度在不同程度上高于野生型,随着胁迫持续,过量表达株系与野生型之间的差异不大,部分基因表达水平仍高于野生型,GAAP3过量表达促进bZIP28通路基因表达峰值提前可能是其抗ER胁迫的原因之一。当采用高浓度5μgⅨmL-1 TM急性胁迫处理植物6 h,野生型、突变体以及过量转化子中UPR下游基因表达无明显差异,说明GAAP3本身并未直接影响UPR基因的表达。进一步通过Western Blot分析了突变体以及GAAP3过量表达转化子中BIP3的水平,结果显示GAAP3过量表达转化子能够上调正常条件下BIP3蛋白的表达量,这可能是其抗ER胁迫的原因之一。3、通过酵母双杂、GST-Pulldown发现GAAP3与UPR重要受体bZIP28互作。通过泛素介导的膜系统酵母双杂检测GAAP与UPR重要元件bZIP17、bZIP28、IRE1a、IRE1b的互作,结果发现当UPR重要元件单独转入酵母细胞时,就能够诱导报告基因的表达。由于bZIP17、bZIP28、IRE1a、IRE1b均是膜蛋白,接下来将它们的跨膜序列敲除,构建了剪切形式bZIP17△C、bZIP28△C、bZIP60△C,通过核系统的酵母双杂发现,GAAP3 与 bZIP17△C、bZIP28△C、bZIP60△C 不互作;通过 GST-Pulldown发现GAAP3与bZIP28在体外直接互作,与剪切形式bZIP28△C不互作。4、构建了GAAP 的多级突变体。由于GAAP3有四个同源基因,本文构建了 GAAP3的双突变体和三突变体,gaap1gaap2gaap3三突变体表现出明显的早花特征,说明GAAPs家族参与了植物的开花调控。综上所述,通过生理水平和细胞水平的探究,发现GAAP3正调控植株对ER胁迫的抗性,通过荧光定量PCR检测发现GAAP3参与调控持续的ER胁迫,并且负调控IRE1通路。GST-Pulldown结果显示GAAP3与bZIP28互作,这些结果表明拟南芥GAAP3可能通过调控UPR受体的功能来提高ER胁迫条件下植物的抗性。