糖尿病肾脏病（diabetic kidney disease,DKD）是糖尿病（diabetes mellitus,DM）最主要的微血管并发症之一,是一种以持续性蛋白尿和肾功能进行性下降为特征的临床综合征,亦是引起慢性肾脏病（chronic kidney disease,CKD）和终末期肾病（end stage renal disease,ESRD）的最常见原因。中医古籍中并无关于DKD独立病名记载,多在消渴病中依据其病机、症状描述为“肾消”“消肾”“水肿”“尿浊”“关格”等。认为本病乃消渴病日久,五脏所伤,穷必及肾的结果。中医学认为“久病入络”,肾脏作为络脉聚集之所,其病变往往表现为肾络结构及功能的异常,故DKD属肾络病变。通心络是在络病学说指导下研制的复方中成药,其“搜、剔、疏、通”的特点使其广泛应用于脉络病变中,前期通心络对于DKD的研究多集中在“孙络-微血管”及肾小球病变。“孙络-玄府”作为络脉“行血气而营阴阳”的最小功能结构载体,暂无从“孙络-玄府”角度论治DKD的研究。因此,本课题从气络学说“孙络-玄府”理论论治DKD以及以肾小管损伤为重点研究本病发病机制具有新的意义。目的:本研究从气络学说“孙络-玄府”角度阐释DKD病机,给“通玄畅络”代表中药复方通心络治疗该病提供新的理论依据。实验部分通过DKD早期动物模型db/db小鼠和高糖高脂诱导的近曲肾小管上皮细胞（HK-2）损伤模型,观察通心络对DKD小鼠肾脏及对高糖高脂诱导的肾小管上皮细胞的保护作用,完善通心络治疗DKD的实验证据,为中医学异病同治思想与中药复方多靶点优势的一致性提供依据。方法:1.理论探讨:本研究理论部分首先对DKD中医病名、病因病机、治则治法方药进行系统梳理。其次将从气络学说“孙络-玄府”理论阐述DKD病机及在此指导下的治疗用药特点。2.实验研究:实验一:选取6周龄SPF级雄性C57BL/Ks小鼠和雄性C57BL/Ks-LepRdb/LepRdb db/db小鼠,适应性喂养2周后,根据体重将db/db小鼠随机分3组,即db/db组（模型组）、db/db+TXL组（通心络治疗组 0.75 g·kg-1d-1）、db/db+Met 组（二甲双胍治疗组 0.2 g·kg-1d-1）。动物分组后即开始灌胃给药,每日1次,每次给予实验小鼠药物处理前,均用电子天平称量小鼠体重,每只小鼠按照0.2mL/10g体重的体积进行灌胃,连续给药12周。C57BL/Ks正常组小鼠和db/db模型组小鼠均予等体积0.5%羧甲基纤维素钠溶液灌胃。从给药0周起,每4周用小鼠代谢笼收集24小时尿液后记录尿量,离心留取上清液,全自动生化分析仪检测尿微量白蛋白及尿肌酐水平。在给药12周实验结束时,小鼠麻醉后处死,收集血液标本,检测各组小鼠血清中血糖（GLU）、尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）、胆固醇（CHO）、甘油三酯（TG）、总蛋白（TP）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）含量。打开小鼠腹腔,摘取双侧肾脏,用于后续苏木素-伊红染色（HE染色）、过碘酸-雪夫染色（PAS）染色和Tunel检测以及蛋白印迹实验（WB）。实验二:体外培养人近曲肾小管上皮细胞（HK-2）,首先将细胞分为8组,低糖组（5 mmol/LD-Glucose,LG）、高糖组（25 mmol/L D-Glucose,HG）、高糖等渗组（5 mmol/L D-Glucose+20 mmol/L D-Mannitol,LGM）、低糖低脂组（5 mmol/L D-Glucose+300 μmmol/L palmitic acid,LGLP）、高糖低脂组（25 mmol/L D-Glucose+300 μmmol/L palmitic acid,HGLP）、低糖高脂组（5 mmol/L D-Glucose+500 μmmol/L palmitic acid,LGHP）、高糖高脂组（25 mmol/L D-Glucose+500 μmmol/L palmitic acid,HGHP）、溶剂对照组（Solvent control）,用MTS检测法观察不同浓度葡萄糖和棕榈酸对HK-2细胞活性的影响,进而确定造模条件。随后用MTS检测法观察不同浓度通心络对糖脂损伤下HK-2细胞的保护作用,确定通心络最佳给药浓度。最后,运用蛋白印迹实验（WB）,观察通心络对糖脂损伤下HK-2程序性细胞死亡不同模式（细胞凋亡、细胞坏死性凋亡、细胞焦亡、细胞铁坏死）的影响,以明确通心络的治疗靶点。实验三:根据实验二确定的通心络作用靶点,运用蛋白印迹实验（WB）,去实验一留存的小鼠肾脏组织去验证靶点。结果:1.理论研究:DKD属消渴病肾病范畴,病位在肾,传统中医认为该病脾肾亏虚为本,涉及心肝肺;燥热、痰瘀、浊毒为标。治疗上,古代辨证论治,重视脾肾,兼顾化瘀;现代倡导分期结合分型论治。尽管对DKD中医病名、病因病机、治则治法方药积累了较为丰富的论述,但DKD病情复杂,虚实交错,缠绵难愈的特点使其在治疗上仍十分棘手。吴以岭院士系统构建络病证治体系,形成气络学说、脉络学说两大学科分支,指出络脉呈现出由经入络、由气及血、由功能性病变发展为器质性病变的慢性病理过程,多有病程较长、疼痛反复发作、迁延难愈的特点。久病入络,久病及肾,显然DKD属于络病研究范畴。肾络迂曲细窄,消渴病日久,燥热、痰瘀、浊毒等侵袭肾络,则易滞易瘀、易积成形,引起肾络损伤,发为消渴病肾病。吴以岭院士率先开启以络论治DKD的研究,认为气阴两虚是DKD的发病基础,络脉瘀阻、津凝痰聚是DKD的主要病理环节,络息成积是DKD的主要病理变化。既往对于DKD的研究多集中从脉络学说微血管病变阐述其病机,本研究从气络学说“孙络-玄府”角度进一步阐释DKD病机及中医药治疗思路。“孙络-玄府”概念的提出,完善了中医藏象系统的结构层系,揭示了运行于孙络中的气血通过玄府有度的开阖与脏腑组织细胞进行物质能量交换与信息传递。无论是从广义上肾小球滤过（开）和肾小管重吸收（阖）功能来看与“孙络-玄府”开阖有度特征的相似性,还是狭义上探讨肾小球滤过屏障有选择的滤过和肾小管上皮细胞受系统调节的分泌功能、离子通道等和“孙络-玄府”结构、功能上的相似性,都提示肾之“孙络-玄府”损伤,开阖失度,是DKD特征。确立“通玄畅络”治法,注重肾乃封藏之本,补虚以助通利肾络,在固护肾中精血津液基础上配以开通玄府郁滞之药,并且注意调节脏腑气机升降出入,总不离“通”、“补”法,以恢复肾之“孙络-玄府”的结构和开阖功能。“通玄畅络”代表药物通心络可以改善DKD发展过程中由于“孙络-玄府”郁滞而致开阖失司导致水谷精微不循其道,下漏而为尿浊（蛋白尿）的症状。2.实验研究:实验一:本部分实验结果证实,db/db小鼠（BKS背景）是良好的DKD早期动物模型,TXL能够减少db/db小鼠24小时尿白蛋白排泄率,降低尿白蛋白尿肌酐比值、改善肾脏形态学异常（减少肾小管上皮细胞空泡变及轻微系膜增生）、减少肾脏Col Ⅰ和Col Ⅳ的表达,抑制肾脏肾小管上皮细胞DNA碎片化。实验二:体外实验发现单纯高糖（25 mmol/L D-Glucose,HG）对HK-2细胞生存活性无影响,当高糖叠加高脂（25 mmol/L D-Glucose+500 μmmol/L palmitic acid,HGHP）时,细胞活性显著降低（p<0.05）。单纯高糖及高糖叠加高脂培养下,HK-2凋亡相关蛋白pro caspase-3,cleaved caspase-3,Bax（促凋亡因子）的蛋白表达均显著升高（p<0.05）,Bcl-2（抑制凋亡因子）和Bcl-2/Bax 比值均显著降低（p<0.05）。这提示HG和HGHP均诱导HK-2细胞凋亡。单纯高糖干预组caspase-1、cleaved GSDMD、IL-1β蛋白表达显著升高,与NC组比较有统计学差异（p<0.05）,但其他焦亡相关蛋白表达与NC组相比无差异。高糖叠加高脂组,细胞焦亡相关蛋白NF-κB p-p65、NLRP3、ASC、pro caspase-1、cleaved caspase-1、cleaved GSDMD和IL-1β的表达均显著升高（p<0.05）,这提示高糖高脂诱导HK-2细胞焦亡。TXL能够抑制这些蛋白表达的改变,与HGHP组比较有统计学差异（p<0.05）。虽然HG、HGHP干预下,细胞坏死性凋亡相关蛋白MLKL、RIP3和细胞铁坏死相关蛋白GPX-4、FACL-4的表达有一些改变,但与NC组相比,无统计学差异。实验三:蛋白印迹实验（WB）结果表明,模型组db/db小鼠肾脏pro caspase-3、cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表达均上调,Bcl-2/Bax降低,与C57BL/Ks正常组小鼠相比,有统计学差异（p<0.05）,说明细胞凋亡激活。TXL治疗组db/db小鼠肾脏pro caspase-3、cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表达下降,Bcl-2/Bax增加,与模型组db/db小鼠相比,有统计学差异（p<0.05）,这提示细胞凋亡明显受到抑制。模型组db/db小鼠肾脏NF-κB p-p65、NLRP3、pro caspase-1,cleaved caspase-1 和 IL-1β 蛋白表达上调,与正常组相比,有统计学差异（p<0.05）,说明细胞焦亡激活。TXL治疗组db/db小鼠肾脏NF-κB p-p65、NLRP3、pro caspase-1,cleaved caspase-1 和 IL-1 β 蛋白表达下降,与模型组 db/db 小鼠相比,有统计学差异（p<0.05）,这提示细胞焦亡明显受到抑制。TXL干预可以抑制db/db小鼠肾脏组织细胞凋亡和细胞焦亡。结论:1.DKD属肾络病变,其病理变化与肾之“孙络-玄府”因郁滞开阖失司、津凝痰聚、络息成积的病理变化相一致。确立“通玄畅络”治法,以通为用、通补结合、通玄固玄需分辨。通心络全方补气通络、剔除络瘀、辛以通玄、搜风畅络,共奏通补之功,标本兼顾,切中DKD病机。2.通心络可以显著减少DKD早期动物模型db/db小鼠尿白蛋白排泄,改善肾脏形态学改变,保护肾功能,其作用与其抑制肾小管上皮细胞凋亡和焦亡有关,主要通过抑制NF-κB p65磷酸化,抑制NLRP3炎症小体相关蛋白表达,从而减少炎症因子IL-1β释放,抑制细胞焦亡。此外,通心络可以抑制促凋亡相关因子Bax以及凋亡执行分子Caspase-3的活化,增加抗凋亡相关因子Bcl-2的表达,从而抑制细胞凋亡。